國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心

2024 年 01 月

目 錄

一、前言 1

二、適用范圍 1

三、一般原則 2

四、生產用物料 3

五、生產工藝 7

六、質量研究與質量標準 9

七、穩(wěn)定性研究 12

八、包裝與密封容器系統(tǒng) 14

九、名詞解釋 14

十、參考文獻 14

一、前言

體內基因治療產品一般選用適當的載體或轉染方式將外源基因（或基因編輯工具）導入人體，通過替代、補償、阻斷、修正特定基因以達到治療疾病的目的。重組腺相關病毒

（recombinant adeno-associated virus，rAAV）載體因其理化性質穩(wěn)定、致病性弱、整合風險低、外源基因表達持久等結構和生物學方面的優(yōu)勢，已成為體內基因治療領域研究、應用最為廣泛的載體之一。

為規(guī)范和指導以 rAAV 為載體的體內基因治療產品（以下簡稱為“rAAV 載體類產品”）按照藥品研發(fā)規(guī)律和相關技 術管理規(guī)范進行研究，提交符合臨床試驗申報要求的藥學研 究資料，根據《中華人民共和國藥品管理法》、《藥品注冊管 理辦法》等相關法律法規(guī)制定本指導原則。本指導原則僅基 于此類產品現階段的研發(fā)水平和科學認知，從技術審評的角 度對此類產品在申報臨床試驗時應完成的藥學研究提出一 般性建議。因不同產品在設計和臨床應用方面可能存在差異， 具體品種的藥學研究可采用具體問題具體分析的原則，但應 能滿足藥學技術評價的需求，并符合臨床試驗用藥品質量的 要求。后續(xù)，相關技術要求將隨著行業(yè)水平的提高、技術的 進步，以及產品認知的積累逐步完善。

二、適用范圍

本指導原則中的 rAAV 載體是指基于腺相關病毒的結構

和理化特性，經設計和重組改造所形成的用于攜帶外源目的基因（或核酸片段）的病毒載體。本指導原則主要針對應用于體內基因治療的 rAAV 載體類產品在申報臨床試驗時應完成和提交的藥學研究信息提出建議。

需要說明的是，對于攜帶基因編輯工具的 rAAV 載體類產品，由于其作用機制涉及對人體細胞基因組的編輯操作， 而當前此類產品的人體研究經驗較為有限，因此仍屬于風險相對較高的產品，可能需要開展更全面的風險評估和質量控制。隨著研究的深入和經驗的積累，相關研究在參考本指導原則的同時，可能需要適當補充和完善相關的技術要求。

三、一般原則

臨床試驗申報階段，rAAV 載體類產品可參考《中國藥典》的相關要求（尤其是“人用基因治療制品總論”的要求），結合申報階段的特點，制定合理的藥學研究計劃和質量控制策略。臨床試驗用藥品應按照“《藥品生產質量管理規(guī)范（2010 年修訂）》臨床試驗用藥品附錄”（2022 年 第 43 號）的相關要求進行生產。臨床試驗用藥品的研發(fā)、生產、使用和廢棄處理應符合生物安全相關法律法規(guī)的要求。

按照藥品研發(fā)的 rAAV 載體類產品應遵循藥品研發(fā)的一般規(guī)律，在臨床試驗申報時提供必要的藥學研究信息，說明和/或證明產品設計的合理性，生產工藝的可重復性，臨床試驗用藥品質量的可控性，分析藥品風險控制策略的合理性和

充分性，最大程度降低藥品的安全性風險，以支持臨床試驗的開展。

rAAV  載體類臨床試驗用藥品可參考《體內基因治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》中的一般原則進行風 險分析和控制。在臨床試驗申報階段一般應完成臨床試驗用 藥品生產相關的種子批、細胞庫的制備和檢定，并開展必要 的穩(wěn)定性研究，以支持臨床試驗用藥品生產所需的傳代代次?；诋a品特點，完成臨床試驗用藥品生產工藝的開發(fā)和初步 確認，并建立必要的生產過程中控制項目。選擇代表性樣品 開展質量研究，并基于對產品質量屬性的理解和前期的數據 積累建立臨床試驗用藥品的質量標準。質量控制相關分析方 法經研究確認，應能滿足分析和質量控制的需求?；诋a品 設計和作用機制，初步建立生物學活性分析方法。臨床試驗 用藥品的穩(wěn)定性研究結果應能支持開展臨床試驗。

由于不同產品之間的風險可能不同，不同研發(fā)階段的產品可能存在設計和工藝方面的差異，為支持人體臨床試驗的安全性，申報臨床試驗時需提供支持申報的非臨床研究樣品與擬用于臨床試驗的藥品在生產用物料、生產工藝、質量等方面的對比信息。臨床試驗用藥品的質量不得劣于非臨床研究用樣品的質量，尤其需要關注與安全性相關的質量屬性。

四、生產用物料

生產用物料是指產品生產過程中所使用的生物或化學材

料，包括起始原材料（如生產/包裝用細胞、包裝用質粒、包裝用病毒等）、生產過程使用或添加的物料（如培養(yǎng)基及其添加成分、核酸酶、純化填料、緩沖鹽、轉染試劑等）、輔料， 以及生產用耗材（如細胞培養(yǎng)袋、濾膜、深層濾器、儲液袋、傳輸管路、暫存容器等）等。

1. 起始原材料

不同病毒包裝系統(tǒng)包裝生產的 rAAV 載體在基因組穩(wěn)定 性、包裝效率、外源因子的引入風險等方面可能存在一定差 異，建議結合產品特點和風險選擇合適的包裝系統(tǒng)用于生產。rAAV   載體生產常見的病毒包裝系統(tǒng)包括質粒瞬時轉染（瞬轉）包裝系統(tǒng)、輔助病毒包裝系統(tǒng)、昆蟲細胞/桿狀病毒包裝 系統(tǒng)等，涉及的起始原材料可能包括包裝用質粒、生產/包裝 用細胞、包裝用病毒等。產品在設計和上游構建方面，可參 考《體內基因治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》中“五、產品設計的一般考慮”和“六、生產用物料”章節(jié) 的相關要求。用于臨床試驗用藥品生產的起始原材料來源應 清晰，具有完整的溯源性信息。申報時，根據包裝系統(tǒng)提供 相應的上游構建信息，以及相關的證明性文件和研究報告， 信息應準確、完整?；诎b系統(tǒng)的類型，藥品生產如涉及 包裝用質粒、包裝用病毒等起始原材料的制備，也應提供相 應的藥學研究信息，具體可參考同類型生物制品原液的申報 資料要求。

（1） 目的基因：詳細說明目的基因的序列和來源信息， 與野生型序列的差異，提供序列設計（如基因篩選、改造和優(yōu)化等）合理性和科學性的依據。

（2） 質粒 DNA：提供質粒構建的具體信息，包括原始質粒的來源、質粒結構圖、重要基因或元件的序列來源及功能信息，詳述質粒構建過程并對最終質粒序列進行確認。提供相關的來源證明和檢定報告。瞬轉生產 rAAV 的包裝用質粒的生產應基于細菌種子批系統(tǒng)，采用適宜的方法純化，并基于風險分析和產品特性對每批質粒進行質量檢測，檢測結果符合要求后方能用于載體生產。

（3） 細菌種子批：瞬轉生產用質粒的生產用菌種需進 行建庫管理，申報時需提供宿主菌的來源、基因型等信息和證明文件，詳述細菌種子和種子批的建立過程。按照《中國藥典》要求進行種子批的檢定，并提供相應的檢定報告。

（4） 病毒種子批：用于 rAAV 載體類產品生產的包裝用病毒應進行建庫管理。申報時需提供原始毒種的來源、歷史培養(yǎng)信息及相關證明文件，如有改造，需詳述病毒種子改造和構建的具體過程，結合溯源信息評估病毒種子的安全性風險。病毒種子批的建立和檢定應滿足《中國藥典》要求， 并提供相應的檢定報告。

（5） 生產/包裝細胞庫：提供 rAAV 載體類產品的生產/ 包裝細胞的來源和證明文件，細胞的歷史溯源信息應完整，

若存在基因改造，應具體說明改造依據、改造方法和改造結果的確認研究等。細胞的溯源信息和質量控制策略應滿足風險控制要求。生產/包裝細胞應進行建庫管理，建庫過程和細胞庫檢定應符合《中國藥典》要求，并提供相應的檢定報告， 尤其應關注種屬特異性病毒和歷史培養(yǎng)、建庫過程中可能引入的病原體的檢定。

細菌/病毒種子批和生產/包裝細胞庫的傳代穩(wěn)定性研究結果應能支持臨床試驗用藥品的生產。包裝用質粒、包裝用病毒的制備和質量控制可參考《體內基因治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》中的相關要求，保存穩(wěn)定性應能滿足生產需求。

2. 其他生產用物料

除起始原材料外，需提供所有其他生產使用的原材料和輔料的來源、生物源性組分、質量標準、使用階段等信息， 并提供相關的證明文件。原材料和輔料的質量控制可參照

《中國藥典》通則“生物制品生產用原材料及輔料質量控制” 的相關要求，質控策略應與其風險相符。如有可能，應盡量避免使用動物源或人源性原材料。如需使用，需提供相關的必要性和合理性說明，并制定相應的風險控制措施。不得使用β內酰胺類抗生素、鏈霉素，以及其他如溴乙錠等有毒有害試劑，盡量減少或避免使用對環(huán)境或人體具有潛在不利影響的試劑，如 Triton X-100 等。

臨床試驗申報時，需提供關鍵的生產用耗材、儀器和設 備的信息。樣品直接接觸的生產用耗材和設備經評估或研究， 應無明顯相容性風險，關注樣品接觸材質對病毒顆粒的吸附 和活性的影響。

五、生產工藝

通過前期的工藝開發(fā)和臨床試驗用藥品的制備，應能建立并初步證明生產工藝的合理性和可重復性，擬定工藝應能穩(wěn)定生產出符合預期質量的臨床試驗用藥品。

申報資料須明確臨床試驗用藥品的生產廠和檢驗廠，提供基本的生產工藝信息，包括生產規(guī)模、工藝流程、具體的工藝參數、過程中控制信息、批次定義等。工藝開發(fā)信息應能支持臨床試驗用藥品生產工藝設定的合理性，如質粒瞬轉工藝中質粒的用量和配比、桿狀病毒感染工藝中的病毒用量和比例、病毒收獲條件、純化工藝條件、制劑處方篩選等。綜合工藝開發(fā)研究信息、非臨床研究用批次和臨床試驗用批次的生產情況，初步評估臨床試驗用藥品的生產工藝的合理性和可重復性。由于 rAAV 載體類產品的細胞包裝產物中， 產品相關雜質種類較多，如空殼病毒等，一般需要通過多個工藝單元進行分離純化。部分分離純化方法，如密度梯度離心等，在工藝放大方面可能具有一定局限性，因此，工藝單元的設定還需考慮后續(xù)生產規(guī)模放大的可能性和可行性。

臨床試驗用藥品的生產工藝應設立必要的過程中控制項

目。建議在適宜的工藝步驟設立微生物安全性相關的控制項目和與產品關鍵質量屬性相關的中控項目。一般建議在病毒收獲液階段常規(guī)開展微生物安全性相關的中控檢測，項目設定應與產品工藝相匹配，常見如無菌/生物負荷、內毒素、支原體、螺原體（如涉及昆蟲細胞或植物源成分）和內/外源病毒因子等檢定。外源因子的檢測可參考《中國藥典》和 ICH Q5A 的要求。

基于產品內/外源病毒因子的風險評估，必要時，應考慮 在工藝步驟中設立病毒清除/滅活工藝單元。一般認為，生產 過程中如使用了包裝用病毒或存在其他內/外源病毒污染風 險時，應考慮在工藝中設立病毒清除/滅活單元以清除/滅活 非目標病毒，如去污劑或低 pH 孵育對包膜病毒的滅活，熱滅活工藝對溫度敏感病毒的滅活，層析和納濾步驟對病毒的 清除等。針對設立的病毒清除/滅活工藝單元，建議參考 ICH Q5A 的一般原則開展病毒清除/滅活驗證研究。如有可能，驗證研究應盡可能將原材料或工藝步驟中可能引入的病毒或 同類病毒納入指示病毒，如昆蟲細胞/桿狀病毒包裝系統(tǒng)中的 桿狀病毒和潛在的彈狀病毒等。有效的病毒清除/滅活工藝單 元病毒滴度下降因子應能達到≥4log₁₀ 的病毒清除/滅活效果?；?/span>于風險評估，必要時，建議考慮設立多種不同原理的病毒 清除/滅活工藝單元?；诓《臼斋@液中非目標病毒的載量檢 測數據，根據驗證研究結果，評估非目標病毒殘留的安全性風險。

六、質量研究與質量標準

1. 質量研究

rAAV 載體類產品的質量研究應根據產品的設計、作用機制和生產工藝等方面確定，一般包括（但不限于）：鑒別、結構分析、一般理化特性、含量、純度、生物學活性、雜質、污染物檢測等。研究樣品應具有代表性，如工藝相近或相同的非臨床研究用樣品、臨床試驗用藥品等。質量研究信息應完整，包括分析方法原理介紹、研究樣品、試驗條件和基本步驟、數據處理和結果分析等，分析方法應能滿足預期用途。

產品的結構和理化特性研究一般包括全基因組的序列分析，單鏈/自身互補型雙鏈組成情況（如適用），衣殼蛋白亞基的分子量、氨基酸序列和翻譯后修飾研究，病毒顆粒的衣殼蛋白亞基比例、熱穩(wěn)定性（溫度變化條件下的病毒顆粒結構表征）、顆粒形態(tài)和粒徑分析等。由于生產過程中 rAAV 載體類產品可能出現基因組不完整或序列突變的情況，建議對病毒基因組完整性進行研究。rAAV 載體類產品的含量、純度和活性分析一般包括載體含量（如病毒顆粒數、基因組滴度、感染滴度等）、衣殼蛋白亞基的純度、病毒顆粒純度、比滴度、生物學活性等。由于 rAAV 載體類產品具有較高的異質性，純度研究需盡量對各類產品相關雜質進行分析，如空殼病毒、部分包裝病毒、游離衣殼蛋白、游離核酸、DNA

錯誤包裝、病毒聚集體、可復制型 AAV 等?；诋a品作用機制的設計，建議初步建立相關的生物學活性分析方法，如對 外源目的基因表達產物正確性的確認，目的基因的表達水平、表達產物的生物學活性等研究。由于作用機制的差異，除基 因編輯類產品外，對于開發(fā)難度較大的表達產物的生物學活 性分析方法，可考慮在臨床試驗期間逐步建立并完善，但建 議在其他研究水平進行質量控制（如表達量等），必要時可與 監(jiān)管機構進行溝通。

結合工藝，對引入的各類工藝相關雜質的殘留水平進行分析或檢測，并評估其安全性風險。例如，S/D 滅活試劑， 親和配基，宿主細胞蛋白，宿主細胞 DNA，生產用質粒（如有），核酸酶，E1A/E1B 基因（如有），有安全性風險的轉染試劑，裂解試劑，氯化銫或碘克沙醇等沉降劑（如有），非目標病毒殘留（如包裝用病毒及其相關雜質等），殘留 DNA 片段大小分布等。對生產中可能引入的污染物如細菌、真菌、支原體、內/外源病毒、細菌內毒素等進行檢測，或結合過程控制進行風險分析。

其他一般特性分析可能還包括外觀、裝量、pH 值、滲透壓、可見異物、關鍵輔料含量、不溶性微粒等。

2. 質量標準

臨床試驗用藥品的質量標準應根據產品特點、生產工藝、質量研究，以及前期對產品認知的積累等綜合評估后擬定。

rAAV   載體類產品的質量標準常見包括一般檢查（如外觀、可見異物、不溶性微粒、滲透壓、pH 值、裝量等）、鑒別（如基因組相關的鑒別、衣殼蛋白亞基相關的鑒別等）、含量（如 病毒顆粒數、基因組滴度、感染滴度等）、比滴度、生物學活 性、純度、產品和工藝相關雜質、可復制型 AAV、污染物、關鍵輔料含量等?？紤]到病毒包裝用細胞的差異，建議持續(xù) 收集包裝用細胞的 DNA 殘留水平和片段大小分布數據，結合病毒包裝用細胞的風險評估，針對 DNA 殘留水平、片段大小、特定轉化因子（如 E1A/E1B 等），及其他特定風險序 列等建立合理的質控策略。由于 rAAV 載體類產品的包裝產物類型較多，擬定的質量標準應能有效控制各類組分的含量， 如病毒顆粒總量，有活性的病毒載體含量，空殼病毒顆粒的 殘留等。一般建議參考非臨床毒理研究批次樣品的質量初步 擬定臨床試驗用藥品的標準限度，特別應關注與安全性相關 的項目，保障臨床試驗用藥品的安全性。

3. 分析方法

申報臨床試驗時，需提供質量控制相關的分析方法信息， 包括方法學原理、分析儀器、試劑耗材、主要操作步驟、數 據處理、結果分析和結果判斷等。對質量控制相關的分析方 法進行確認研究。由于部分產品相關雜質，如空殼病毒、部 分包裝病毒等理化特性與目標產物較為接近，分離和定量分 析相對困難，建議選擇分離度好、性能穩(wěn)定的分析方法用于

質量控制。可復制型 AAV 作為 rAAV 載體類產品中與安全性相關的重要控制項目，應建立敏感、適用的分析方法。分析方法中靶細胞的傳代方式、培養(yǎng)條件，以及輔助病毒的類型和用量應有利于可復制型 AAV 的復制和檢出，檢測靶點的選擇需充分考慮可復制型 AAV 產生的方式和類型。鑒于不同衣殼類型的 AAV 對細胞的感染特性可能存在差異，方法建立需關注檢定用細胞、輔助病毒、對照設立的適用性。一般認為，相同血清型或衣殼類型的陽性對照病毒可能在感染特性方面更具有代表性。

根據檢測需要，建立質控分析用標準品/對照品。標準品

/對照品的建立、制備和保管可參照《中國藥典》“生物制品國家標準物質制備和標定規(guī)程”的相關要求?；跇藴势?/span>/對照品的特性和使用目的，進行特性分析（如結構、活性、純度、含量和其他特性等）、標定和穩(wěn)定性研究，并確保標準品/對照品的可溯源性。

七、穩(wěn)定性研究

參考《生物制品穩(wěn)定性研究技術指導原則（試行）》、《體內基因治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》等指南開展 rAAV 載體類產品的穩(wěn)定性研究，可能涉及的研究樣品包括生產中間品、原液和制劑等，研究條件和包裝容器應具有代表性，考察指標應能敏感反應樣品的穩(wěn)定性，常見的考察指標包括如一般理化特性、外觀、不溶性微粒、含量（如

病毒顆粒數、基因組滴度、感染滴度等）、比滴度、純度、生物學活性、污染物、關鍵輔料含量等。研究項目一般包括長期穩(wěn)定性、加速穩(wěn)定性、影響因素研究等，建議重點關注凍融、高溫等病毒敏感條件對樣品的影響。對于產量較少的產品（尤其是罕見病用藥），基于質量屬性在穩(wěn)定性方面的變化特征，對于穩(wěn)定性研究過程中一定期限內可能無顯著變化趨勢的質量屬性檢項，經充分評估后，可考慮在該期限內適當減少檢測取樣點，或檢測其他具有相關性的質量屬性，如除初期和末期需進行無菌檢查外，部分檢測點可采用容器的密閉完整性檢測作為無菌的支持性檢測等。

根據臨床試驗用藥品生產和使用可能涉及的運輸，結合穩(wěn)定性研究，開展運輸風險評估，必要時應開展運輸穩(wěn)定性研究。參考臨床試驗方案，開展臨床使用穩(wěn)定性研究。不同適應癥設計的 rAAV 載體類產品的臨床給藥方式可能較為多樣，部分給藥器械可能會對 rAAV 載體類產品產生明顯的吸附作用或活性影響，導致產品滴度下降。建議關注 rAAV 載體類產品與擬定使用的給藥器械之間的相容性，并通過模擬臨床給藥流程，考察給藥劑量的準確性和產品的安全性，評估產品的滴度、純度、生物學活性、不溶性微粒、微生物相關安全性等是否會受給藥器械和給藥流程的影響。

產品的穩(wěn)定性研究應能支持臨床試驗的開展。

八、包裝與密封容器系統(tǒng)

提供與樣品接觸的包裝材料的選擇依據和相關信息，包括供應商、包材組成、包裝材質、質量標準、供應商提供的 相容性研究等。開展相關的研究或評估，初步分析說明包材 的適用性、密封性和相容性符合臨床試驗用藥品的使用要求。部分產品內包材，如環(huán)烯烴聚合物（cyclic olefin polymer）類包材等，可能具有一定的透氣性，建議關注儲存期間二氧化 碳等氣體的滲透風險，充分評估包裝材料的適用性和風險控 制策略。

九、名詞解釋

部分包裝病毒：是指存在基因組部分缺失或衣殼組裝不完整的病毒顆粒。

DNA 錯誤包裝：指非目的基因組 DNA（如宿主細胞 DNA、質粒 DNA 等）包裝入病毒顆粒的情況。

比滴度：通常以總顆粒數或病毒基因組滴度與感染滴度的比值表示，使用時應予以明確。

十、參考文獻

[1] 國家藥典委員會.《中華人民共和國藥典》（ 2020 年版）.2020.

[2] NMPA.《藥品生產質量管理規(guī)范（2010 年修訂）》臨床試驗用藥品附錄. 2022.[3] CDE. 體內基因治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）[EB/OL].2022.[4] NMPA. 生物制品穩(wěn)定性研究技術指導原則（試行）[EB/OL].2022.

來源原文鏈接：CDE