1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:微生物計(jì)數(shù)法

微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氣條件下生長(zhǎng)的啫溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。

當(dāng)本法用于檢查非無菡制劑及其原、輔料等是否符合規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下述規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)走外，本法不適用于活菌制劑的檢查。

微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求。檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格道守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。潔凈空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí)，若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及對(duì)微生物無毒性。

供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。

計(jì)數(shù)方法

計(jì)數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法(Most-Probable-Number Method,簡(jiǎn)稱MPN法)。MPN法用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，但對(duì)于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是更適合的方法。

供試品檢查時(shí)，應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計(jì)數(shù)方法，檢測(cè)的樣品量應(yīng)能保證所獲得的試驗(yàn)結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定，所選方法的適用性須經(jīng)確認(rèn)。

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

供試品微生物計(jì)數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。

供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。

若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗(yàn)。

菌種及菌液制備

菌種 試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代)，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用菌株見表1

菌液制備 按表1規(guī)定程序培養(yǎng)名試驗(yàn)菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物,用pH7.0無菌氣化鈉-蛋白際緩沖液或0.9%無菌氣化鈉溶液制成適宣濃度的菌懸液;取黑曲蛋的新鮮培養(yǎng)物加入適量含0.05%(m/ml)駿山梨配80的pH7.0無菌氣化鈉-蛋自陳緩沖液或含0.05%(ml/ml)聚山梨醋80的0.9%無菌氣化鈉溶液,將孢子洗脫，然后，采用適宜的方法吸出孢子懸波至無菌試管內(nèi)，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菡氣化鈉-蛋自陳緩沖液或含0.05%(m/m|)聚山梨酷80的0.9%無菌氣化溶液制或適宜濃度的黑曲蛋孢子懸液。

菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用;若保存在2~8℃,可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲蛋孢子是波可保存在2~8℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。

陰性對(duì)照

為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無菌生長(zhǎng)。如陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。

培養(yǎng)基適用性檢查

微生物計(jì)數(shù)用的商品化的預(yù)制培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。

按表1規(guī)定，接種不大于100cfu的菌液至胰酶大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糟瓊脂培養(yǎng)基平板，置表1規(guī)定條件下培養(yǎng)。每一試驗(yàn)菌株平行制備2管或2個(gè)平板。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。

被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5~ 2范圍內(nèi),且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致;被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。

計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

1.供試液制備

根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液，供試:液制備若需加溫時(shí)，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過45℃，供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過1小時(shí)。

常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認(rèn)均不適用，應(yīng)建立其他適宜的方法。

水溶性供試品 取供試品,用pH7.0無菌氣化鈉-蛋自胨緩沖液,或pH7.2磷酸鹽緩沖中液，或胰酯大豆陳液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1:10供試液。著需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6~8，必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。

水不溶性非油脂類供試品 取供試品,用pH7.0無菌氣化鈉-蛋白陳緩沖液，或pH7.2磷酸鹽緩,沖液，或胰酯大豆陳液體培養(yǎng)基制備成1:10供試液，分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1%6(m/ml)的聚山梨醋80，使供試品分散均勻。若需要,調(diào)節(jié)供試液pH值至6~8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。

油脂類供試品 取供試品，加入無菌十四烷酸異丙醋使溶解，或與最少是并能使供試品乳化的無菌聚山梨醒80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過40℃(特殊情況下，最多不超過45”℃),小心混臺(tái),若需要可在水浴中進(jìn)行,然后加入預(yù)熱的稀釋液使成1:10供試液，保溫，混臺(tái)，并在最短時(shí)間內(nèi)形成乳狀液。必要時(shí)，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進(jìn)一步10倍系列稀釋。

膜劑供試品 取供試品，剪碎，加oH7.0無菌氣化鈉-蛋自陳緩沖液，或pH7.2磁酸鹽緩沖液，或建韻大豆陳液體培養(yǎng)墓，漫泡，振猩，制成1:10的供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6~8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。

腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品 取供試品，加入pH6.8無菌磷酸鹽緩)中液(用于腸溶制劑)或pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液(用于結(jié)腸溶制劑)，置45℃水浴中，振搖，使溶解，制成1:10的供試液。必要時(shí)，用同一釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。

氣霧劑供試品 取供試品，置-20℃或其他適宜溫度冷凍約1小時(shí)，取出,迅速消毒供試品開啟部位或閥門。正置容器，用無菌鋼錐或針樣設(shè)備在與閥門結(jié)構(gòu)相匹配的適宜位置鉆一小孔，供試品各容器的鉆孔大小和深度應(yīng)盡是保持一致,拔出鋼錐時(shí)應(yīng)無明顯拋射劑拋出，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩釋出。亦可采用專用設(shè)備釋出拋射劑，釋放拋射劑后再無菌開啟容器，并將供試品轉(zhuǎn)移至無菌容器中混合,必要時(shí)用沖洗液沖洗容器內(nèi)壁。供試品亦可采用其他適直的方法取出，然后取樣檢查。

貼劑、貼營(yíng)劑供試品 取供試品，去掉防粘層，將枯貼面朝上放置在無菌玻璃成塑料器皿上，在枯貼面上要蓋一層適宜的無菌多孔材料(如無菌到布)，避免供試品粘貼在一起。將處理后的供試品放入盛有適宜體積并含有表面活性劑(如駿山梨酯80或卵磷脂)稀釋液的容器中，振蕩至少30分鐘，必要時(shí)，用同-稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。

2. 接種和稀釋

按表1規(guī)定及下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗(yàn)用供試液，所加菌波的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。

試驗(yàn)組 取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每1m|供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu。

供試品對(duì)照組 取制備好的供試液，以稀擇液代替菌液同試驗(yàn)組操作。

菌液對(duì)照組 取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o法選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適直的方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果供試品對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。

3.抗菌活性的去除或滅活

供試液接種后，按下列"微生物回收"規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值小于菌液對(duì)照組菌落數(shù)值的50%,可采用下述方法消除供試品的抑菌活性，

(1)增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。

(2)加入適直的中和劑或滅活劑

中和劑或滅活劑(表2)可用于消除干擾物的抑菌活性,最好在稀釋液或培養(yǎng)基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)中和劑或滅活劑對(duì)照組，即取相應(yīng)量含中和劑或滅活劑的稀釋液替代供試品同試驗(yàn)組操作，以確認(rèn)其有效性和對(duì)微生物無毒性。中和劑或滅活劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5~2范圍內(nèi)。

(3)采用薄膜過濾法

(4)上述幾種方法的聯(lián)合使用

若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對(duì)特定試驗(yàn)菌回收的失敗，表明供試品對(duì)該試驗(yàn)菌具有較強(qiáng)抗菌活性，同時(shí)也表明供試品不易被該類微生物污染。但是，供試品也可能僅對(duì)特定試驗(yàn)菌株具有抑制作用，而對(duì)其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。若方法適用性試驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行供試品檢查。

4.供試品中微生物的回收

表1所列的計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用的各試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。微生物的回收可采用平皿法、薄膜過濾法或MPN法。

(1) 平皿法 平Ⅲ法包括傾注法和涂布法。表1中每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平皿，以算術(shù)平均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。

傾注法 取照上述"供試液的制備“"接種和稀釋"和"抗菌活性的去除或滅活"制備的供試液1ml,晉直徑90mm的無菌平皿中,注入15~20m!溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆陳瓊脂或沙氏葡萄糖瓊臘培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。若使用直徑較大的平皿,培養(yǎng)基的用是應(yīng)相應(yīng)增加。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。

涂布法 取適量(通常為15~20m)溫度不超過45“的胰酪大豆陳瓊臘或沙氏帶萄糖瓊臘培養(yǎng)華,注入直徑90mm的無菌平皿,凝固，制成平板采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。若使用直徑較大的平皿,培養(yǎng)基用是也應(yīng)相應(yīng)增加。每一平板表面接種上述照"供試液的制備""接種和稀釋"和"抗榮活件的去除或滅活"制備的供試液不少于0.1m1，按表1規(guī)宗條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)，計(jì)算名試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。

(2) 薄膜過濾法 薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45um，直徑一般為50mm,若采用其他直徑的濾膜,沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。供試品及其溶劑應(yīng)不影響濾膜材質(zhì)對(duì)微生物的截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液要蓋整個(gè)濾膜表面，供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液,沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量一般為100m1，總沖洗量一般不超過500m!，最多不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。

取照上述"供試液的制備“"接種和稀釋”和"抗菌活性的去除或滅活"制備的供試液適量(一般取相當(dāng)于1g、1ml或10cm'的供試品，若供試品中所含的菌數(shù)較多時(shí)，供試液可的情減量)，加至適量的稀釋液中，混勻，過濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。

若測(cè)定需氣菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酶大豆胨瓊臘培養(yǎng)基平板上;若測(cè)定毒苗和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜，同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。

(3)MPN法 MPN法的精密度和準(zhǔn)確度不及薄膜過濾法和平皿計(jì)數(shù)法，僅在供試品需氣菌總數(shù)沒有適直計(jì)數(shù)方法的情況下使用，本法不適用于要菡計(jì)數(shù)。若使用MPN法，按下列步躲進(jìn)行。

取照上述"供試液的制備“"接種和稀釋"和"抗菌活性的去除或滅活"制備的供試液至少3個(gè)連續(xù)稀釋級(jí),每一樣釋級(jí)取3份1ml分別接種至3管裝有9~10ml眭酪大豆陳液體培養(yǎng)基中，同法測(cè)定菌液對(duì)照組菌數(shù)。必要時(shí)可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。

接種管晉30~35℃培養(yǎng)不超過3天，逐日觀賓各管微生物生長(zhǎng)情況，如果由于供試品的原因使得結(jié)果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酯大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)1~2天,觀家是否有微生物生長(zhǎng)。根據(jù)微生物生長(zhǎng)的管數(shù)從表3查被測(cè)供試品1g、1ml或10cm'中需氣菌總數(shù)的最可能數(shù)。

5.結(jié)果判斷

計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過濾法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5~2范用內(nèi);采用MPN法時(shí)，試驗(yàn)組菌數(shù)應(yīng)在菌液對(duì)照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi)，若各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氣菌總數(shù)、番菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。

方法適用性確認(rèn)時(shí)，若采用上述方法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求，那么選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢查。

供試品檢查

檢驗(yàn)量

檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量(g、ml或cm')。

一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于2個(gè)最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗(yàn)。

除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10m;膜劑、貼劑和貼育劑為100cm。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得少于4丸，膜劑、貼劑和貼育劑還不得少于4片。

貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。若供試品處方中每一劑量單位(如片劑、膠囊劑)活性物質(zhì)含量小于或等于1mg，或每1g或每1m(指制劑)活性物質(zhì)會(huì)量低于1mg時(shí)，檢驗(yàn)是應(yīng)不少于10個(gè)劑量單位或10g或10m|供試品;若樣品量有限或批產(chǎn)星極小(如:小于1000ml或1000g)的活性物質(zhì)供試品，除另有規(guī)定外，其檢驗(yàn)是最少為批產(chǎn)量的1%，檢驗(yàn)量更少時(shí)需要進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估;若批產(chǎn)量少于200的供試品，檢驗(yàn)是可減少至2個(gè)單位;批產(chǎn)量少于100的供試品，檢驗(yàn)量可減少至1個(gè)單位。

供試品的檢查

按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氣菌總數(shù)、霍菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定。

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酯大豆胨瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)定需氣菌總數(shù);

沙氏葡萄糟瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)定蛋菌和酵母菌總數(shù)

陰性對(duì)照試驗(yàn) 以稀釋液代替供試液進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，明性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無菌生長(zhǎng)。如果陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行差調(diào)查。

1.平皿法

平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和菌數(shù)測(cè)定，每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平板。

培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 除另有規(guī)定外，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在30~35℃培養(yǎng)3~5天,沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在20~25℃培養(yǎng)5~7天，觀索菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)平板上生長(zhǎng)的所有菌落數(shù),計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落莫延生長(zhǎng)成片的平板不直計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后,計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù),按菡數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落數(shù)平均值不小于15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。

菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 需氣菌總數(shù)測(cè)定直選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級(jí)、蛋菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于100cf的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)授告的依據(jù)。取最高的平均菌落數(shù)，計(jì)算19、1ml或10cm“供試品中所含的微生物數(shù)，取兩位有效數(shù)字報(bào)告。

如各稀釋級(jí)的平板均無菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以<1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。

2.薄膜過濾法

除另有規(guī)定外，按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備。取相當(dāng)于19、1ml或10cm“供試品的供試液,著供試品所會(huì)的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液，照方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法加至適量稀釋液中，立即過濾,沖洗,沖洗后取出濾膜,菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糟瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。

菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 以相當(dāng)于1g、1ml或10cm“供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù);若濾膜上無菌落生長(zhǎng),以<1報(bào)告菌數(shù)(每張濾膜過濾1g、1ml或10cm'供試品)，或<1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。

3.MPN法

取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和供試品接種，所有試驗(yàn)管在30~35℃培養(yǎng)3~5天，如果需要確認(rèn)是否有微生物生長(zhǎng)，按方法適用性試驗(yàn)確定的方法進(jìn)行。記錄每一稀釋級(jí)微生物生長(zhǎng)的管數(shù)，從表3查每19、1ml或10cm“供試品中需氣菌總數(shù)的最可能數(shù)。

結(jié)果判斷

需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)(包括真菌菌落數(shù));蛋菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)(包括細(xì)菌菌落數(shù))。若國(guó)沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌使蛋苗和酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素(如氨重素、慶大蛋素)的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基(如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基)進(jìn)行毒菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定。使用選擇性培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查，若采用MPN法，測(cè)主結(jié)果為需氣菌總數(shù)。

各品種項(xiàng)下規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)解釋如下

若供試品的需氣菌總數(shù)、蛋菌和酶母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定;若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。

稀釋液、沖洗液及培養(yǎng)基

見非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:控制菌檢查法(通則1106)。