附件：9251 細菌內毒素檢查法應用指導原則草案公示稿（第一次）

 9251 細菌內毒素檢查法應用指導原則

本指導原則是對細菌內毒素檢查法的內容及應用做進一步的說明。

1. 細菌內毒素限值的設定

   產品的細菌內毒素限值一般是通過公式 L=K/M 計算得到的。其中 M 為人用每千克體重每小時最大供試品劑量，可參考藥品說明書或具有權威性資料的用法用量。

   制定品種細菌內毒素限值時，應考慮以下情況。

（1）聯合用藥應考慮其他制劑可能引入的細菌內毒素；兒科用藥、營養(yǎng)不良用藥和惡病質用藥等，應考慮細菌內毒素對體弱患者人群可能導致更嚴重的影響。因此，制定上述品種細菌內毒素限值時，可在計算值的基礎上適當嚴格。

（2）100ml 及以上裝量的大輸液類制劑，其細菌內毒素限值一般不得超過 0.50EU/ml。

（3）制定具有多種規(guī)格注射液的細菌內毒素限值時，限值的單位應與產品臨床用法用量（M）的標示單位一致，如 EU/mg、EU/U 或 EU/ml。

（4）注射或植入眼內的藥物產品，其細菌內毒素限值一般不得超過 2.0 EU/劑。眼科沖洗產品的內毒素限值一般不得超過 0.5 EU/ml。制定原料藥的細菌內毒素限度值時，應參考其制劑的細菌內毒素限值。

（4）制定原料藥的細菌內毒素限度值時，應參考其制劑的細菌內毒素限.

（5）制定原輔料和藥包材的細菌內毒素限值時，應根據制劑內毒素控制的要求，基于風險評估，采用具體問題具體分析的原則。應根據其在制劑中的用量，結合生產工藝，評估各組分對制劑引入細菌內毒素污染的潛在風險，合理分配每一種成分和藥包材的內毒素限值。以確保即使每種成分和藥包材細菌內毒素污染達到其限值，按照批準的生產工藝生產的制劑細菌內毒素檢查仍符合規(guī)定。

2. 細菌內毒素檢查方法的選擇

   細菌內毒素檢查法（通則 1143）包括凝膠法檢測和光度檢測技術法共 6種細菌內毒素檢查方法。供試品檢測時可以選用其中任何一種方法進行細菌內毒素檢查。

（1）凝膠法檢測技術 凝膠法檢測技術的優(yōu)點是操作簡便，供試品在排除干擾作用后均可使用凝膠法檢測技術進行檢驗。

   凝膠法檢測技術的干擾試驗是確定供試品能否使用凝膠法檢測技術的決定因素。進行干擾實驗時，應挑選與鱟試劑反應呈陰性的樣品進行。

   若樣品稀釋到 MVD 仍不能排除干擾作用，應進一步對供試品的前處理進行研究，再用干擾試驗驗證能否使用凝膠法檢測技術。

（2）光度法檢測技術 光度法檢測技術（包括濁度法和顯色法）可定量檢測內毒素的含量，能較為準確評估產品在生產過程中污染的相對風險，定量檢測的數據不僅有利于追蹤產品質量趨勢，還能起到風險預警的作用，達到數據完整性的要求。

   供試品能否采用光度法檢測技術進行檢測，須通過干擾試驗確定。光度法檢測技術測定法可通過回收率判斷出干擾的趨勢，尤其對于研究性質的樣品（如新產品）更具有優(yōu)勢。

   由于光度法檢測技術的檢測范圍比凝膠法檢測技術寬，使得有干擾的樣品可以有更大的稀釋倍數，對于部分使用凝膠法檢測技術無法排除干擾的樣品，可以嘗試使用光度法檢測技術建立細菌內毒素檢測方法。

       3.供試品的前處理方法

   除另有規(guī)定外，一般應使用內毒素檢查用水（BET 水）溶解或稀釋樣品進行細菌內毒素檢查。常見的干擾因素和排除干擾的前處理方法見表 1。

在水中溶解度低的樣品可以采取超聲波、加熱助溶、添加助溶劑、調節(jié)pH 等方法提高其溶解度。當采用適宜的有機溶劑（乙醇、DMSO 等）進行溶解時，必須進行干擾試驗驗證內毒素的回收。

難溶性或溶解度較低的樣品可依據樣品特性，選擇適宜的方法進行前處理，前處理包括樣品的溶解和干擾的排除。樣品的溶解方法可采用調節(jié) pH 、加熱、超聲、添加助溶劑等方式溶解，也可采用有機溶劑溶解；溶解后干擾的排除方法可采用內毒素檢查用水稀釋、酸堿緩沖液稀釋、超濾、萃取等方式。當采用上述方法進行供試品前處理時，應在供試品或供試品溶液中預先添加內毒素標準品，再與供試品同步處理后進行干擾試驗來驗證前處理方法不會對內毒素產生破壞或干擾作用。供試品前處理所用試劑的內毒素含量應對試驗無影響。采用包合技術的新型制劑如微球、脂質體等供試品，應采取適宜方法將包合體破壞，使包裹在內部的細菌內毒素完全釋放，再進行檢測。

對于容器類藥包材一般采用加入標示容量的內毒素檢查用水浸泡容器內腔的方法進行供試液制備；對于非容器類的藥包材，應將藥包材置于無熱原玻璃器皿內，一般加入不超過 40mL 的細菌內毒素檢查用水進行供試液制備，其中針對體積較大或者較小的藥包材，可以相應的增加或者減少提取液的體積，同時在內毒素限量值方面做出相應的調整。對于無菌供應的藥包材，應采用 37℃±1℃，提取不少于 1h 的條件制備供試液；對于非無菌供應的包裝無菌藥品的藥包材，應按照所包裝制劑推薦的滅菌條件進行供試液制備。

4.產品細菌內毒素檢查法的建立

建立品種的細菌內毒素檢查法時，為驗證樣品和不同生產廠家鱟試劑反應的一致性，應使用兩個生產廠家的鱟試劑對至少三批樣品進行干擾試驗。

建立產品細菌內毒素檢查法時，若無法排除供試品對細菌內毒素檢查的干擾作用，或只能使用最高靈敏度鱟試劑（凝膠法檢測技術為 0.03EU/ml，光度法檢測技術為 0.001EU/ml）才能排除干擾，則該品種不宜建立細菌內毒素檢查項。

5.其他

 5.1實驗時，當使用規(guī)格大于 0.1ml/支裝量的鱟試劑時，為避免鱟試劑支間活性差異帶來的影響，可將鱟試劑復溶后混合，再分裝到反應容器中使用。凝膠法檢測技術常用的反應容器為適宜的玻璃小試管或空安瓿等，光度法檢測技術常用的反應容器為測定儀專用試管或酶標板。塑料材質可能會引起干擾，使用前應進行驗證。

5.2 采用凝膠法檢測技術檢驗時，如果計算出的 MVD 值不是整數，可以使用小于 MVD 的整數進行實驗。當出現陽性結果時，為判斷產品是否合格，需采用計算的 MVD 重新測試。當遇到不合格結果時，應進行全面的回顧調查，確定試驗的有效性。為了獲得不合格供試品的細菌內毒素含量值，凝膠檢測和光度檢測中均可以采用超過 MVD 的稀釋倍數進行檢驗。

目前新的細菌內毒素檢測方法不斷出現，以適應特殊品種細菌內毒素檢查的需要，或減少鱟試劑的使用量。

5.3 供試品和鱟試劑的加樣量一般為 0.1ml，也可采用其他加樣量進行內毒素檢測，如采用小于 0.1ml 加樣量開展凝膠試驗，或采用其他加樣量進行動態(tài)顯色法。動態(tài)顯色法加樣體積、預設 OD 值、所用微孔板等，應參照試劑生產商的相關說明使用。如采用的加樣量較小時，實驗的準確性更容易受試驗操作、環(huán)境污染、試管孔徑（如凝膠試驗因所用的試管孔徑較小而受表面張力影響，使鱟試劑與樣品的反應混合物流動較慢，易被誤判為凝膠形成，

應注意觀察）等外界條件的影響，因此對試驗人員的操作水平和環(huán)境的清潔度有較高的要求。結果如有爭議時，可采用加樣量為 0.1ml 的凝膠限度實驗進行仲裁。

5.4 低內毒素回收，也稱為內毒素掩蔽，是指無法使用細菌內毒素檢查法正常檢測到無菌制劑 （特別是蛋白類生物制劑）中的加標內毒素的現象。判斷低內毒素回收的方法是將已知濃度的標準內毒素添加到未稀釋的樣品中，隨著時間的推移，標準內毒素的回收率無法達到≥50％。低內毒素回收會導致樣品中的內毒素污染水平可能被低估或未被檢測出。該現象無法通過稀釋來排除，需要在建立樣品內毒素檢測方法時進行研究。

對于存在低內毒素回收現象的產品，可通過調整樣品處理或試驗方法來恢復對細菌內毒素的檢測能力。緩解低內毒素回收的措施應結合產品本身特性，采用在樣品中添加分散劑、添加過量的二價金屬離子、使用有機溶劑增加樣品的疏水性等方式。如無法緩解低內毒素回收現象，應采用熱原檢查法或其他替代方法。

5.5 重組 C 因子法（見本通則附：重組 C 因子法）、微量凝膠法等為細菌內毒素檢查法的補充方法。當采用重組 C 因子法細菌內毒素檢查法（通則 1143）中未收載的方法檢測產品的細菌內毒素時，應符合“凡例”的相關規(guī)定。

附重組 C 因子法

C 因子是鱟試劑中對細菌內毒素敏感的蛋白，能夠選擇性識別內毒素。重組 C 因子是一種人工合成的 C 因子，它被細菌內毒素活化后，可與熒光底物作用產生與內毒素濃度成比例的熒光信號。

本法系依據反應混合物中的內毒素濃度和其孵育終止時的熒光值之間存在量化關系來測定細菌內毒素的含量。本法為終點熒光法。依據檢測原理， 本法不存在 G 因子旁路干擾，具有較高的專屬性，因此適合于含有β葡聚糖干擾的樣品檢測；本法所用試劑不含有 B 因子和凝固酶原、凝固蛋白原等，因此含有對上述物質抑制或增強作用的樣品適合使用重組 C 因子法。

重組 C 因子法試驗需采用熒光酶標儀，其激發(fā)和發(fā)射波長等參數參照試劑的使用說明書，激發(fā)/發(fā)射波長一般為：380nm/440nm，檢測溫度一般為 37℃±1℃。儀器靈敏度（增益值）調節(jié)、重組 C 因子試劑的配制方法、保溫時間等，參照所用儀器和試劑的有關說明進行。

標準曲線的可靠性試驗、干擾試驗、檢查法以及結果判斷 參照細菌內毒素檢查法（通則 1143）中的方法 2 光度法檢測技術。

起草單位：中國食品藥品檢定研究院 聯系電話：010-53851594

9251 細菌內毒素檢查法應用指導原則修訂說明

本次修訂的主要內容說明如下：

1.在“細菌內毒素限值的設定”項下，參考 USP 1085，新增了眼科用藥的內毒素限值制定；將原料、輔料、包材限度制定綜合考慮制定要求。

2.在“供試品的前處理方法”項下，參考 USP 1085，增加了常見的干擾和排除措施；對難溶性樣品的前處理方法和要求，進行詳細描述；增訂藥包材樣品的前處理方法。

3.在“其他”項下，提出使用塑料材質試管需先進行驗證的要求；參考USP 1085，增加當遇到不合格結果時的相關建議；增加當采用小于 0.1ml 加樣量開展內毒素試驗時應注意的問題；增加對低內毒素回收現象的描述，以及處理方法的介紹；明確重組 C 因子法為細菌內毒素檢查法補充方法。

4.全文依據 1143 細菌內毒素檢查法 的修訂，對本文中凝膠試驗和光度試驗的方法名稱進行相應的修改。

來源：藥典委

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