本指導(dǎo)原則是為所采用的試驗方法能否替代藥典規(guī)定的方法用于藥品微生物檢驗提供指導(dǎo)。

隨著微生物學(xué)的迅速發(fā)展，制藥領(lǐng)域不斷引入了一些新的微生物檢驗技術(shù),大體可分為三類:①基于微生物生長信息的檢驗技術(shù)，如生物發(fā)光技術(shù)電化學(xué)技術(shù)、比濁法等;②直接測定被測介質(zhì)中活微生物的檢驗技術(shù),如固相細(xì)胞計數(shù)法、流式細(xì)胞計數(shù)法等;③基于微生物細(xì)胞所含有特定組成成分的分析技術(shù)，如脂肪酸測定技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)、基因指紋分析技術(shù)等。這些方法與傳統(tǒng)檢査方法比較，或簡便快速，或具有實時或近實時監(jiān)控的潛力，使生產(chǎn)早期采取糾正措施及監(jiān)控和指導(dǎo)優(yōu)良生產(chǎn)成為可能，同時新技術(shù)的使用也促進(jìn)了生產(chǎn)成本降低及檢驗水平的提高。

在控制藥品微生物質(zhì)量中，微生物實驗率出于各種原因,如成本、生產(chǎn)量、快速簡便及提高藥品質(zhì)量等需要而采用非藥典規(guī)定的檢驗方法(即替代方法)時，應(yīng)進(jìn)行替代方法的驗證，確認(rèn)其應(yīng)用效果優(yōu)于或等同于藥典的方法。微生物檢驗的類型及驗證參數(shù)。

藥品微生物檢驗方法主要分兩種類型:定性試驗和定量試驗。定性試驗就是測定樣品中是否存在活的微生物,如無菌檢査及控制菌檢查。定量試驗就是測定樣品中存在的微生物數(shù)量，如微生物計數(shù)試驗。

由于生物試驗的特殊性，如微生物檢驗方法中的抽樣誤差、稀釋誤差、操作誤差、培養(yǎng)誤差和計數(shù)誤差都會對檢驗結(jié)果造成影響，因此，分析方法驗證指導(dǎo)原則(指導(dǎo)原則9101)不完全適宜于微生物替代方法的驗證。藥品微生物檢驗替代方法的驗證參數(shù)見表1。

盡管替代方法的驗證參數(shù)與藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證參數(shù)有相似之處，但是其具體的內(nèi)容是依據(jù)微生物檢驗特點而設(shè)立的。替代方法驗證的實驗結(jié)果需進(jìn)行統(tǒng)計分析，當(dāng)替代方法屬于定性檢驗時，一般采用非參數(shù)的統(tǒng)計技術(shù);當(dāng)替代方法屬于定量檢驗時，需要采用參數(shù)統(tǒng)計技術(shù)。

進(jìn)行微生物替代方法的驗證時，若替代方法只是針對藥典方法中的某一環(huán)節(jié)進(jìn)行技術(shù)修改，此時，需要驗證的對象僅是該項替代技術(shù)而不是整個檢驗方法。如無菌試驗若改為使用含培養(yǎng)基的過濾器，然后通過適宜的技術(shù)確認(rèn)活的微生物存在，那么，驗證時僅需驗證所用的微生物回收系統(tǒng)而不是整個無菌試驗方法。

替代方法驗證的一般要求

在開展普代方法對樣品檢驗的適用性驗證前，有必要對替代方法有一個全面的了解。首先，所選用的普代方法應(yīng)具備必要的方法適用性證據(jù)，表明在不含樣品的情況下，替代方法在不同類型的微生物檢驗中所具有的專屬性、精密度和檢測限等參數(shù)。這些證據(jù)或由替代方法的研發(fā)者提供，或由方法使用者完成。

使用者在基本確認(rèn)替代方法的適用件后，應(yīng)采用樣品按表1規(guī)定的參數(shù)逐一進(jìn)行驗證,以確認(rèn)替代方法可否用于該樣品的檢驗。驗證至少使用2個批號的樣品，每批樣品應(yīng)平行進(jìn)行至少3次獨立實驗，

在開展各參數(shù)驗證時，涉及的菌種除應(yīng)包括非無蘭產(chǎn)品微生物限度檢査:微生物計數(shù)法(通則1105)，非無菌產(chǎn)品微牛物限度檢音:控制菌檢查法(通則1106)和無菌檢査法(通則1101)中培養(yǎng)基適用性檢査規(guī)定的菌株外，還應(yīng)根據(jù)替代方法及樣品的待點增加相應(yīng)的菌株。各菌種應(yīng)分別進(jìn)行驗證。

樣品中微生物定性檢驗方法的驗證

1.專屬性

微生物定性檢驗的專屬性是指檢測樣品中可能存在的特定微生物種類的能力。當(dāng)替代方法以微生物生長作為判斷微生物是否存在時,其專屬性驗證時應(yīng)確認(rèn)所用培養(yǎng)墓的促生長試驗，還應(yīng)考慮樣品的存在對檢驗結(jié)果的影響。當(dāng)替代方法不是以微生物生長作為判斷指標(biāo)時，其專屬性驗證應(yīng)確認(rèn)檢測系統(tǒng)中的外來成分不得干擾試驗而影響結(jié)果,如確認(rèn)樣品的存在不會對檢驗結(jié)果造成影響。采用替代方法進(jìn)行控制菌的檢驗，還應(yīng)選擇與控制菌具有類似特性的菌株作為驗證對象。

2.檢測限

微生物定性檢驗的檢測限是指在替代方法設(shè)定的檢驗條件下，樣品中能被檢出的微生物的最低數(shù)量。由于微生物所具有的特殊性質(zhì)，檢測限是指在稀釋或培養(yǎng)之前初始樣品所含有的微生物數(shù)量，而不是指檢驗過程中某一環(huán)節(jié)的供試液中所含有的微生物數(shù)量。例如控制菌檢査中規(guī)定不得檢出沙門菌，對檢測限而言，是指每10g樣品中能被檢出的沙門菌的最低數(shù)量。

檢測限確定的方法是在樣品中接種較低濃度的試驗菌(每單位不超過5cu)，然后分別采用藥典方法和替代方法對該試驗菌進(jìn)行檢驗，以檢出與否來比較兩種方法的差異。試驗菌的接種量須根據(jù)試驗而定，以接種后采用藥典方法50%的樣品可檢出該試驗菌為宜。檢測限驗證至少應(yīng)重復(fù)進(jìn)行5次。對于同一種試驗菌可采用卡方檢驗(X)來評價兩種方法的檢測限是否存在差異。

3.重現(xiàn)性

微生物定性檢驗的重現(xiàn)性是指相同的樣品在正常的實驗條件(如實驗地點、實驗人員、儀器、試劑的批次等)發(fā)生變化時，所得檢驗結(jié)果的精密度,重現(xiàn)性可視為微生物檢驗方法在檢驗結(jié)果上抵抗操作和環(huán)境變化的能力。方法使用者應(yīng)優(yōu)先測定該驗證參數(shù)。在樣品中接種一定數(shù)量的試驗菌(接種量應(yīng)在檢測限以上)，采用藥典方法和替代方法，分別由不同人員，在不同時間,使用不同的試劑(或儀器)進(jìn)行檢驗，采用卡方檢驗(X)來評價兩種方法的重現(xiàn)性是否存在差異。驗證過程中，應(yīng)關(guān)注樣品的一致性。

4. 耐用性

微生物定性檢驗的耐用性是指當(dāng)方法參教有小的刻意變化時,檢驗結(jié)果不受影響的能力，為方法正常使用時的可靠性提供依據(jù)。方法使用者應(yīng)優(yōu)先測定該驗證參數(shù)。與藥典方法比較，若替代方法檢驗條件較為苛刻，則應(yīng)在方法中加以說明。替代方法與藥典方法的耐用性比較不是必須的,但應(yīng)單獨對替代方法的耐用性進(jìn)行評價，以便使用者了解方法的關(guān)鍵操作點。

樣品中微生物定量檢驗方法的驗證

散生物定量檢驗一般都涉及菌落計數(shù)。對計數(shù)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時通常需要使用統(tǒng)計的方法。由于菌落計數(shù)服從治松分布,因此采用治松分布的統(tǒng)計方法對計數(shù)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理優(yōu)于采用正態(tài)分布的統(tǒng)計方法。檢驗者往往習(xí)慣采用正態(tài)分布的統(tǒng)計方法，因此也可以通過對數(shù)轉(zhuǎn)換或加1后開方的方法將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布數(shù)據(jù)后再進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩種統(tǒng)計方法都適用于微生物數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

1.準(zhǔn)確度

微生物定量檢驗的準(zhǔn)確度是指替代方法的檢驗結(jié)果與藥典方法檢驗結(jié)果一致的程度。準(zhǔn)確度的確認(rèn)應(yīng)在檢測的范圍內(nèi),通常用微生物的回收率(%)來表示。

檢測范圍內(nèi)的準(zhǔn)確度都應(yīng)符合要求,準(zhǔn)確度驗證的方法是:制備試驗菌的菌是液,菌縣液的濃度應(yīng)選擇為能夠準(zhǔn)確計數(shù)的最高濃度，然后系列稀釋至較低濃度(如小于10cfu/ml)。例如,菌落計數(shù)平皿法的替代方法,在制備高濃度菌是液時,其濃度可以是10°cfu/ml,并系列稀釋至10'cfu/ml。每個試驗菌應(yīng)至少選擇5個菌濃度進(jìn)行準(zhǔn)確度確認(rèn)，替代方法的檢驗結(jié)果不得少于藥典方法檢驗結(jié)果的70%，也可以采用合適的統(tǒng)計學(xué)方法表明替代方法的回收率至少與藥典方法一致。當(dāng)替代方法的回收率高于藥典方法時,有必要結(jié)合專屬性項下的有關(guān)內(nèi)容對準(zhǔn)確度進(jìn)行評價。

2.精密度

微生物定量檢驗的精密度是指在檢驗范圍內(nèi)，對同一個均勻的樣品多次重復(fù)取樣測定，其檢驗結(jié)果的一致程度,通常采用標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示，也可以采用其他適宜的方式

精密度驗證的方法是:制備試驗菌的菌是液,菌縣液的濃度應(yīng)選擇為能夠準(zhǔn)確讀數(shù)的最高濃度，然后系列稀釋至較低濃度(如小于10cfu/ml)。每個試驗菌選擇其中至少5個濃度的菌是液進(jìn)行檢驗。每一個濃度至少應(yīng)進(jìn)行10次重復(fù)檢驗，以便能夠采用統(tǒng)計分析方法得到標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差般情況下，可以接受的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)不大于35%。不考慮特殊的檢驗結(jié)果,替代方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)不大于藥典方法。例如，藥典菌落計數(shù)平皿法其可接受的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)與含菌濃度的關(guān)系見表2.

3.專屬性

微生物定量檢驗的專屬性是指通過檢測適宜的試驗菌,以證明檢驗方法與其設(shè)定目的相適應(yīng)的能力。例如，菌落計數(shù)平皿法其設(shè)定目的在于檢出一定數(shù)量的微生物，則其專屬性驗證應(yīng)證明當(dāng)樣品中存在一定數(shù)量的試驗菌時,通過平皿法檢驗,能夠檢出試驗菌,而樣品的存在不會對結(jié)果造成影響,。專屬性驗證時，應(yīng)能夠設(shè)計出可能使替代方法出現(xiàn)假陽性的實驗?zāi)Ｐ蛠硖魬?zhàn)替代方法,從而確認(rèn)替代方法的適用性。當(dāng)替代方法不依賴微生物生長出菌落或出現(xiàn)混濁就可以定量時(如不需要增菌或在1~50cfu范圍內(nèi)就可直接測定菌數(shù)的定量方法)，以上驗證方式就顯得更為重要。

4. 定量限

微生物定量檢驗的定量限是指樣品中能被準(zhǔn)確定量測定的微生物最低數(shù)量，由于無法得到含有已知微牛物教量的實驗樣品，因此，在定量限驗證時應(yīng)選擇在檢驗范圍內(nèi)至少5個菌濃度，每個濃度重復(fù)取樣測定不少于5次，替代方法的定量限不得大于藥典方法。需要注意的是，由于細(xì)菌計數(shù)和菌落數(shù)服從泊松分布，可能存在計數(shù)結(jié)果的誤差，因此替代方法的定量限僅需證實在相近的低限度下其靈敏度至少相當(dāng)于藥典方法。

定量限驗證的方法是:在檢驗范圍的低限制備5份不同含菌濃度的菌懸液,每份菌縣液分別用藥典方法和替代方法進(jìn)行不少于5次檢驗,采用統(tǒng)計方法比較替代方法的檢驗結(jié)果與藥典方法結(jié)果的差異，從而評價替代方法的定量限。

5.線性

微生物定量檢驗的線性是指在一定范圍內(nèi),檢驗結(jié)果與樣品中微生物數(shù)量成比例關(guān)系的程度。線性驗證時必須覆蓋能夠準(zhǔn)確測定的所有濃度范圍。每株試驗菌應(yīng)選擇至少5個濃度，每個濃度至少測定5次，根據(jù)以上實驗數(shù)據(jù),以檢驗結(jié)果為因變量,以樣品中微牛物的預(yù)期數(shù)量為自變量進(jìn)行線件回歸分析，計算相關(guān)系數(shù)。當(dāng)相關(guān)系數(shù)不能準(zhǔn)確評估線性時,只能確定簡單大約的關(guān)系值。替代方法的相關(guān)系數(shù)不得低于0.95.

6.范圍

微生物定量檢驗的范圍是指能夠達(dá)到一定的準(zhǔn)確度、精密度和線性，檢驗方法適用的高低限濃度或數(shù)量的區(qū)間。

7.重現(xiàn)性

微生物定量檢驗的重現(xiàn)性是指相同的樣品在正常的實驗條件(如實驗地點、實驗人員、儀器、試劑的批次等)發(fā)生變化時,所得檢驗結(jié)果的精密度重現(xiàn)性可視為微生物檢驗方法在檢驗結(jié)果上抵抗操作和環(huán)境變化的能力。方法使用者應(yīng)優(yōu)先測定該驗證參數(shù)。在樣品中接種一定數(shù)量的試驗菌(接種里應(yīng)在定量限以上)，采用藥典方法和替代方法,分別由不同人員,在不同時間,使用不同的試劑(或儀器)進(jìn)行檢驗，對檢驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來評價兩種方法的重現(xiàn)性差異。驗證過程中，應(yīng)關(guān)注樣品的一致性。

8.耐用性

微生物定量檢驗的耐用性是指當(dāng)方法參數(shù)有小的刻意變化時，檢驗結(jié)果不受影響的能力，為方法正常使用時的可靠性提供依據(jù)。方法使用者應(yīng)優(yōu)先測定該驗證參數(shù)。與藥典方法比較，若替代方法檢驗條件較為苛刻，則應(yīng)在方法中加以說明。替代方法與藥典方法的耐用性比較不是必須的，但應(yīng)單獨對替代方法的耐用性進(jìn)行評價，以便使用者了解方法的關(guān)鍵操作點。

來源：藥典委