9106 基于基因芯片的藥物評(píng)價(jià)技術(shù)與方法指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則規(guī)定了將基因芯片技術(shù)用于藥物安全性和有效性評(píng)價(jià)的原理、定義、主要技術(shù)指標(biāo)和待測(cè)樣品的要求、樣品圖譜的制作及分析方法。目的是規(guī)范基于基因枝片技術(shù)的藥物安全性、有效性評(píng)價(jià)研究,,為該類研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、方法學(xué)建立等過(guò)程和測(cè)定方法的適用范圍提供指導(dǎo)性的原則要求。

一、定義及原理

藥物基因組學(xué)(pharmacogenomics),又稱基因組藥物學(xué)或基因組藥理學(xué),是藥理學(xué)的一個(gè)分支,定義為在基因組學(xué)的基礎(chǔ)上,通過(guò)將基因表達(dá)或單核苷酸的多態(tài)性與藥物的療效或毒性聯(lián)系起來(lái)，研究藥物如何由于遺傳變異而產(chǎn)生不同的作用,。

毒理基因組學(xué)(toxicogenomics)是從多基因、全基因組水平研究毒物作用與基因表達(dá)的相互影響,其研究?jī)?nèi)容主要包括3個(gè)方面:促進(jìn)環(huán)境應(yīng)激原與疾病易感性關(guān)系的理解、闡明毒性分子機(jī)制、篩選和確認(rèn)與疾病和毒物暴露相關(guān)的生物標(biāo)志物(biomarkers)。

DNA微陣列(DNA microarray)又稱DNA陣列或DNA芯片,比較常用的名字是基因芯片(gene chip)。是一塊帶有DNA微陣列(microaray)的特殊玻璃片或硅芯片，在數(shù)平方厘米的面積上布放數(shù)千或數(shù)萬(wàn)個(gè)核酸探針;樣品中的DNA、CDNA、RNA等與探針結(jié)合后,借由熒光或電流等方式檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度,進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。經(jīng)由一次測(cè)定,即可提供大量基因序列相關(guān)信息,以高通量、多因素、微型化和快速靈敏的特點(diǎn)而見(jiàn)長(zhǎng)。

原理:利用生物分子相互間的特導(dǎo)識(shí)別作用進(jìn)行生物信號(hào)處理

根據(jù)檢測(cè)樣本的不同，基因芯片可分為表達(dá)譜芯片(CDNA芯片)、SNP(單核苷酸多態(tài)性,singlenucleotide polymorphism)芯片、miRNA芯片、SiRNA芯片、染色質(zhì)免疫共沉淀芯片(chromatin immunoprecipitation-chip,CHIP-chip)和DNA甲基化芯片(MeDIP-chip)等

二、基本原則

基于基因組學(xué)技術(shù)的藥物安全性、有效性評(píng)價(jià)方法應(yīng)符合藥物基因組學(xué)研究的隨機(jī)、對(duì)照、重復(fù)的基本原則;具備簡(jiǎn)單、精確的特點(diǎn);應(yīng)有明確的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

三、基本內(nèi)容

1.生物樣本的獲取

試驗(yàn)系的選擇 基于基因芯片技術(shù)的藥物安全性、有效性評(píng)價(jià)方法中所用的試驗(yàn)系,包括整體動(dòng)物、離體器官、血清、組織、細(xì)胞等。試驗(yàn)系的選擇與試驗(yàn)原理和測(cè)定指標(biāo)密切相關(guān)，應(yīng)選擇背景資料清楚、影響因素少、檢測(cè)指標(biāo)靈敏和成本低廉的試驗(yàn)系統(tǒng)。應(yīng)盡可能研究各種因素對(duì)試驗(yàn)系的影響，采取必要的措施對(duì)影響因素進(jìn)行控制。

如采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,盡可能使用大鼠和小鼠等來(lái)源多,成本低的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,并說(shuō)明其種屋、品系、性別和周齡。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用應(yīng)道循"優(yōu)化、減少、替代"的"3R"原則。

供試品選擇 應(yīng)選擇工藝穩(wěn)定，質(zhì)量合格的供試品。應(yīng)至少使用3批供試品。若為飲片，應(yīng)基源清楚。

標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌愤x擇 采用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌肪鶓?yīng)有理論依據(jù)和/或?qū)嶒?yàn)依據(jù)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中采用的標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌返氖褂脩?yīng)符合國(guó)家有關(guān)規(guī)定要求

2.生物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)原理 所選實(shí)驗(yàn)方法的原理應(yīng)明確，檢測(cè)指標(biāo)靈敏度高，客觀、專屬性強(qiáng)。

設(shè)計(jì)類型 試驗(yàn)設(shè)計(jì)可考慮設(shè)供試品組、陰性對(duì)照組或陽(yáng)性對(duì)照組，使用動(dòng)物模型應(yīng)考慮設(shè)置模型對(duì)照組，對(duì)于重現(xiàn)性好的試驗(yàn),可不設(shè)或僅在復(fù)試時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組，

劑量設(shè)計(jì) 按照生物檢定的要求，參照藥物臨床用藥劑量進(jìn)行合理的劑量設(shè)計(jì)，試驗(yàn)劑量的選擇以產(chǎn)生采用基因芯片能檢測(cè)到生物效應(yīng)為宜;在制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中，應(yīng)采取多劑是試驗(yàn)，并充分說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)中設(shè)定限值劑量的依據(jù) 

給藥途徑 與臨床用藥途徑一致。如采用不同的給藥途徑，應(yīng)說(shuō)明理由，

給藥次數(shù) 根據(jù)藥效學(xué)研究合理設(shè)計(jì)給藥次數(shù)，可采用多次或單次給藥,盡量與臨床用藥給藥次數(shù)一致

指標(biāo)選擇 應(yīng)客觀、明確、專屬，與藥物藥效或安全性相關(guān)。

生物祥本處理 應(yīng)盡量使用無(wú)菌、一次性型料制品，已標(biāo)明不含有核糖核酸酶(RNase-free)且未開封過(guò)的型料制品;在試劑中可適當(dāng)加入一定量的RNA穩(wěn)定劑;盡量確定每次處理樣本的最大數(shù)量,減少處理過(guò)程對(duì)RNA整體性的影響:需要對(duì)影響RNA質(zhì)量的多個(gè)因素進(jìn)行評(píng)價(jià):如樣品量等。在收集到生物樣本后，最好能即刻進(jìn)行RNA制備工作,若需暫時(shí)儲(chǔ)存,則應(yīng)以液氨將生物樣本急速冷凍后,儲(chǔ)存于-80℃冰箱中。在制備RNA時(shí),將儲(chǔ)存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細(xì)胞。不可先行解凍，以避免RNase的作用。

3,基因芯片技術(shù)

為了基因林片分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確、穩(wěn)定和可靠,應(yīng)建立并嚴(yán)格執(zhí),行基因林片技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)?；诨蛐酒夹g(shù)的藥物安全性、有效性評(píng)價(jià)方法主要包括:基因芯片制備、樣本獲取、總RNA提取(extraction)、體外擴(kuò)增(amplification)、標(biāo)記(labeling)、芯片雜交(hybridization)、洗滌(wash)、差異基因檢測(cè)、分析及驗(yàn)證,以下內(nèi)容詳細(xì)說(shuō)明各流程中的主要原理及注意事項(xiàng)

RNA提取、分離和制備 RNA的提取主要包括組織、細(xì)胞、全血或外周加單核細(xì)胞(PBMCS)中RNA的提取，常見(jiàn)的RNA提取方法有TRIZOl法、苯酚法和胍鹽/-巰基乙醇法等;提取的總RNA采用RNA純化試劑盒純化,純化后不應(yīng)存在對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶等有抑制作用的物質(zhì)，排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染，盡量避免蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子等污染。

基因芯片的制備 以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或CDNA作為探針按順序排列在載體上。

熒光標(biāo)記 在基因組DNA擴(kuò)增過(guò)程中,將帶有Cv3或Cv5英光素的dUTP或dCTP加入到新合成的DNA鏈,使新合成的DNA鏈帶有熒光標(biāo)識(shí)。

雜交和洗滌 使帶有熒光標(biāo)記gDNA/CDNA與基因芯片上的探針進(jìn)行特異性互補(bǔ)結(jié)合的過(guò)程稱為雜交。

基因芯片掃描(microarray scanning) 將雜交后的基因芯片置于芯片掃描儀內(nèi)獲得不同探針雜交信號(hào)強(qiáng)度的全貌圖

基因芯片數(shù)據(jù)分析 采用圖像分析軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析,將圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào),對(duì)芯片上的數(shù)據(jù)采用局部加權(quán)回歸散點(diǎn)平滑法(locallvweighted scatter plot smoothing,LOWESS或LOESS)進(jìn)行歸一化,根據(jù)Cy3或Cy5信號(hào)強(qiáng)度和比值判斷差異基因。采用實(shí)時(shí)英光定量PCR對(duì)差異表達(dá)基因定量，驗(yàn)證差異表達(dá)基因。

4.方法學(xué)驗(yàn)證

(1)測(cè)定方法影響因素 應(yīng)考察測(cè)定方法的各種影響因素,確定最佳的試驗(yàn)條件,以保證試驗(yàn)方法的專屬性和準(zhǔn)確性。根據(jù)對(duì)影響因素考察結(jié)果,規(guī)定方法誤差控制限值或?qū)y(tǒng)計(jì)有效性進(jìn)行說(shuō)明。

(2)精密度考察  應(yīng)進(jìn)行重復(fù)性、中間精密度、重現(xiàn)性考察。

重復(fù)性 按確定的測(cè)定方法，至少用3批供試品、每批3次或同批供試品進(jìn)行6次測(cè)定試驗(yàn)后對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)?；蛐酒瑴y(cè)定試驗(yàn)結(jié)果判斷應(yīng)基本一致。

中間精密度 考察試驗(yàn)內(nèi)部條件改變(如不同人員、不同儀器、不同工作日和實(shí)驗(yàn)時(shí)間)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

重現(xiàn)性 基因芯片測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果必須在3家以上實(shí)驗(yàn)室能夠重現(xiàn)。

(3)方法適用性考察 按擬采用的基因林片測(cè)定方法和劑量對(duì)10批以上該產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)定,以積累數(shù)據(jù)，考察質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中該測(cè)定項(xiàng)目的適用性。

來(lái)源：藥典委