9104近紅外分光光度法指導(dǎo)原則

近紅外分光光度法系通過(guò)測(cè)定物質(zhì)在近紅外光譜區(qū)(波長(zhǎng)范圍約在780~2500nm,按波數(shù)計(jì)約為12800~4000cm-)的特征光譜并利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法提取相關(guān)信息，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的一種光譜分析技術(shù)。近紅外光譜主要由C-H、N-H、O-H和S-H等基團(tuán)基頻振動(dòng)的倍頻和合頻組成由于其吸收強(qiáng)度遠(yuǎn)低于物質(zhì)中紅外光譜(4000~400cm-1)的基頻振動(dòng)，而且吸收峰重疊嚴(yán)重，因此通常不能直接對(duì)其進(jìn)行解析，而需要對(duì)測(cè)得的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理后，才能進(jìn)行定性、定量分析。

應(yīng)用范圍

近紅外分光光度法具有快速、準(zhǔn)確、對(duì)樣品無(wú)破壞的檢測(cè)特性，不僅能進(jìn)行"離線(xiàn)“分析,還能直接進(jìn)行"在線(xiàn)”“過(guò)程控制;不僅可以直接測(cè)定原料和制劑中的活性成分，還能對(duì)藥品的某些理化性質(zhì)如水分、脂肪類(lèi)化合物的羥值、碘值和酸值等進(jìn)行分析;并能對(duì)藥物輔料、中間產(chǎn)物以及包裝材料進(jìn)行定性和分級(jí)。

儀器裝置

1.儀器

近紅外分光光度計(jì)由光源、單色器(或干涉儀)、采樣系統(tǒng)、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理器和評(píng)價(jià)系統(tǒng)等組成。常采用高強(qiáng)度的石英或鎢燈光源,但鎢燈比較穩(wěn)定;單色器有聲光可調(diào)型、光柵型和棱鏡型;樣品池、光纖探頭、液體透射池、積分球是常用的采樣裝置;硅、硫化鉛、砷化銦、銦鎵砷、汞鎘確和氘代硫酸三甘肽檢測(cè)器為常用的檢測(cè)器。檢測(cè)器和采樣系統(tǒng)需根據(jù)供試品的類(lèi)型選擇。

2.儀器性能的校驗(yàn)與自檢

為確保儀器能達(dá)到預(yù)期的應(yīng)用目的，應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)參比物質(zhì)(SRM)對(duì)儀器的性能定期進(jìn)行校驗(yàn)，并在使用中通過(guò)自檢確保儀器的適用性。近紅外光譜儀的校驗(yàn)參數(shù)通常包括波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度、吸收/反射度的精密度、線(xiàn)性及最大和最小光通量處的噪聲。近紅外光譜儀的自檢通常通過(guò)比較實(shí)測(cè)光譜與校驗(yàn)時(shí)儲(chǔ)存于儀器中的標(biāo)準(zhǔn)光譜的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)。自檢時(shí)除針對(duì)上述校驗(yàn)參數(shù)設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)闹笜?biāo)外，還應(yīng)考慮分析過(guò)程中波長(zhǎng)的漂移和靈敏度的改變。

儀器的校驗(yàn)除應(yīng)定期進(jìn)行外，當(dāng)維修光路或更換光學(xué)部件如光源或采樣附件后也,應(yīng)進(jìn)行。推薦用于藥物分析的近紅外光譜儀校驗(yàn)參數(shù)見(jiàn)下表。

①通常在2500nm(4000cm-1)處儀器允許的最大漂移為10nm(16cm-1)。

②SRM1920a是美國(guó)NIST提供的用于近紅外波長(zhǎng)校正的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),通過(guò)SRM1920a對(duì)儀器1935nm處的光譜峰進(jìn)行校準(zhǔn)，來(lái)確定波長(zhǎng)的準(zhǔn)確性。

③AOBS指觀測(cè)的吸光度，AREF指反射標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在3個(gè)特定波長(zhǎng)處的吸光度

測(cè)量模式

近紅外光譜分析中常采用透射或反射測(cè)量模式。

1.反射模式(又稱(chēng)漫反射模式)

反射模式主要用于分析固體樣品，近紅外光可穿至樣品內(nèi)部1~3mm，未被吸收的近紅外光從樣品中反射出。分別測(cè)定樣品的反射光強(qiáng)度(I)與參比反射表面的反射光強(qiáng)度(L)，其比值為反射率R。Ig(1/R)與波長(zhǎng)或波數(shù)的函數(shù)為近紅外光譜。

R=J/L

AR=lg(1/R)=Ig(H/I)

固體樣品的顆粒大小、形狀、緊密程度及其他物理性質(zhì)均會(huì)引起光譜基線(xiàn)的漂移,因此不是所有的固體混合物均符合比爾定律?？捎脭?shù)學(xué)方法減弱或消除粒度的影響。最常用的數(shù)學(xué)方法為對(duì)光譜進(jìn)行導(dǎo)數(shù)處理。當(dāng)樣品量足夠大時(shí)，也可用多元散射校正方法處理數(shù)據(jù)。

2.透射模式

透射模式主要用于分析液體樣品，近紅外光穿過(guò)樣品，透射光強(qiáng)度(I)與波長(zhǎng)或波數(shù)的函數(shù)為近紅外光譜。測(cè)定樣品時(shí)樣品置于光源與檢測(cè)器之間的光路上，結(jié)果直接以透光率(7)或吸光度(A)表示。

T=I/L6

A=-lgT=lg(1/T)=lg(I/I)

式中 兒為入射光強(qiáng)度。

透射-反射模式為透射與反射模式的結(jié)合，將反射鏡置樣品的后部,光源與檢測(cè)器在樣品的同側(cè)，近紅外光穿過(guò)樣品后經(jīng)反射鏡返回,因此光程增加為兩倍。

四、影響近紅外光譜的主要因素

環(huán)境溫度、樣品的光學(xué)性質(zhì)、多晶型、樣品的含水量和溶劑殘留量、樣品厚度、硬度、光潔度及樣品的貯存時(shí)間等均對(duì)樣品的近紅外光譜有影響。液體樣品對(duì)環(huán)境溫度最敏感，不同晶型的樣品通常具有不同的近紅外光譜。

五、應(yīng)用近紅外分光光度法進(jìn)行定性、定量分析的基本要求

(一)定性分析

利用近紅外分光光度法進(jìn)行定性分析的主要步驟包括:收集代表性樣品,測(cè)定光譜,選擇化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)圖譜進(jìn)行預(yù)處理和降維處理，建立定性分析模型，對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。

1.代表性樣品的選擇

選擇適宜的代表性樣品(如不同的生產(chǎn)工藝、物理形態(tài)、粒度分布等)建立定性分析模型。模型中各類(lèi)樣品的性質(zhì)決定了模型的適用范圍。

2.圖譜預(yù)處理和降維處理

為有效地提取有用信息，排除無(wú)效信息，在建立分類(lèi)或校正模型時(shí)需要對(duì)譜圖進(jìn)行數(shù)學(xué)預(yù)處理。歸一化處理常用于消除或減弱由位置或光程變化所導(dǎo)致的基線(xiàn)平移或強(qiáng)度變化，導(dǎo)數(shù)處理可以提音語(yǔ)圖的分辨率,但導(dǎo)數(shù)處理的同時(shí)擴(kuò)大了噪聲,因此常輔以平滑處理來(lái)消除噪聲:對(duì)固體樣品，采用多元散射校正(MSC)或標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(SNV)校正可以消除或減弱光散射引入的基線(xiàn)偏移。

多元近紅外光譜數(shù)據(jù)包含有大量的相關(guān)變量(共線(xiàn)性),建模時(shí)需要減少變量,即用一組新的不相關(guān)但包含相應(yīng)信息的變量來(lái)代表所有數(shù)據(jù)的變化建立模型。常用的減少變量的方法是主成分分析(PCA)法。

3.建立定性分析模型

建立定性分析模型就是將樣品的性質(zhì)與光譜的變化相關(guān)聯(lián),用光譜的差異程度來(lái)區(qū)分樣品的性質(zhì)。定件分析中常采用模式識(shí)別的方法對(duì)具有相似特征的樣品進(jìn)行分組。模式識(shí)別方法包括判別分析和聚類(lèi)分析。判別分析要求對(duì)樣本的類(lèi)別特征有明確的定義，并按定義區(qū)分樣本;而聚類(lèi)分析適用于僅需要對(duì)樣本進(jìn)行分組而不需要預(yù)先知道這些樣品彼此間的確切關(guān)系。

4.模型的驗(yàn)證

對(duì)定性分析模型，至少應(yīng)進(jìn)行模型的專(zhuān)屬性和重現(xiàn)性?xún)煞矫娴尿?yàn)證，

(1)專(zhuān)屬性模型的專(zhuān)屬性通常用對(duì)已知樣品的鑒別正確率表示。不僅需要驗(yàn)證真品的鑒別正確率,還需要用化學(xué)結(jié)構(gòu)或性質(zhì)上與模型中物質(zhì)相近的樣品進(jìn)行挑戰(zhàn)性驗(yàn)證，證明模型能區(qū)分出這些物質(zhì)。

(2)耐用性模型的耐用性系指在不改變模型參數(shù)的情況下,考査正常操作中的微小變化對(duì)模型預(yù)測(cè)結(jié)果的影響。通常包括①不同操作者的影響;

②環(huán)境條件(如實(shí)驗(yàn)室中的溫度、濕度變化)的影響

③操作(如樣品在光學(xué)窗口的位置、液體探頭的測(cè)量深度、包裝狀況)的影響;

④儀器部件的更換。

(二)定量分析

利用近紅外分光光度法進(jìn)行定量分析的主要步驟包括:收集樣品并進(jìn)行檢驗(yàn)，選擇代表性樣品,測(cè)定光譜,選擇化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)圖譜進(jìn)行預(yù)處理和降維處理，建立定量分析模型，對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。

1.代表性樣品的選擇

根據(jù)樣品的收集及檢驗(yàn)情況，選擇能包括全部樣品理化性質(zhì)差異的適宜數(shù)量的樣品作為建模樣品。建模樣本的含量范圍應(yīng)該寬于預(yù)測(cè)樣品的范圍,必要時(shí)可以通過(guò)加速實(shí)驗(yàn)或特殊制備的方式獲得。

2.圖譜預(yù)處理和降維處理參見(jiàn)”定性分析”

3.建立定量分析模型

近紅外光譜測(cè)量時(shí)一般不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理,但測(cè)量時(shí)可受多種因素的影響,利用單波長(zhǎng)光譜數(shù)據(jù)很難獲得準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果?，F(xiàn)代近紅外光譜定量分析均利用多波長(zhǎng)光譜數(shù)據(jù)，采用多元校正的方法,如多元線(xiàn)性回歸(MLR)、主成分回歸(PCR)、偏最小二乘回歸(PLSR)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)等建立分析模型。

4.方法學(xué)驗(yàn)證

近紅外分光光度法定量分析的方法學(xué)驗(yàn)證與其他分析方法的要求相似。每個(gè)被驗(yàn)證參數(shù)可被接受的限度范圍與該方法的應(yīng)用目的有關(guān)，通常應(yīng)考慮專(zhuān)屬性、線(xiàn)性、準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性。

六、近紅外模型的再驗(yàn)證

當(dāng)預(yù)測(cè)物質(zhì)的物理性質(zhì)改變，或物質(zhì)的來(lái)源改變，如產(chǎn)品的組成、生產(chǎn)工藝、原(輔)料的來(lái)源或級(jí)別發(fā)生改變時(shí),需要對(duì)已建立的定量模型進(jìn)行再驗(yàn)證。必要時(shí)應(yīng)對(duì)模型進(jìn)行維護(hù)或建立新模型。

七、近紅外模型的傳遞

近紅外模型的傳遞表示模型在不同的近紅外光譜儀中的適用情況。當(dāng)近紅外模型在非建模儀器中應(yīng)用時(shí)，必須考慮儀器型號(hào)、數(shù)據(jù)格式、光譜范圍.數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)量、光譜分辨率等對(duì)模型的影響。用適宜的代表性樣品(數(shù)量依據(jù)具體模型確定)分別在建模儀器(源機(jī))和其他儀器掃描光譜，分別利用不同儀器上獲得的光譜預(yù)測(cè)結(jié)果，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，以確證該模型在其他儀器中使用是否有效。

來(lái)源：藥典委