9012 生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則

一、范圍

準確測定生物基質(zhì)(如全血、血清、血漿、尿)中的藥物濃度,對于藥物和制劑研發(fā)非常重要。這些數(shù)據(jù)可被用于支持藥品的安全性和有效性，或根據(jù)毒動學(xué)、藥動學(xué)和生物等效性試驗的結(jié)果做出關(guān)鍵性決定。因此，必須完整地驗證和記錄應(yīng)用的生物分析方法,以獲得可靠的結(jié)果。

本指導(dǎo)原則提供生物分析方法驗證的要求,也涉及非臨床或臨床試驗樣品實際分析的基本要求，以及何時可以使用部分驗證或交叉驗證，來替代完整驗證。本指導(dǎo)原則二和三主要針對色譜分析方法，四針對配體結(jié)合分析方法。

生物樣品定量分析方法驗證和試驗樣品分析應(yīng)符合本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求。應(yīng)該在相應(yīng)的生物樣品分析中道守GLP原則或GCP原則。

二、生物分析方法驗證

(一)分析方法的完整驗證

分析方法驗證的主要目的是，證明特定方法對于測定在某種生物基質(zhì)中分析物濃度的可靠性。此外,方法驗證應(yīng)采用與試驗樣品相同的抗凝劑。一般應(yīng)對每個新分析方法和新分析物進行完整驗證。當難于獲得相同的基質(zhì)時，可以采用適當基質(zhì)替代，但要說明理由，一個生物分析方法的主要特征包括:選擇性、定量下限、響應(yīng)函數(shù)和校正范圍(標準曲線性能)、準確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、分析物在生物基質(zhì)以及溶液中儲存和處理全過程中的穩(wěn)定性。有時可能需要測定多個分析物。這可能涉及兩種不同的藥物,也可能涉及一個母體藥物及其代謝物,或一個藥物的對映體或異構(gòu)體。在這些情況下驗證和分析的原則適用于所有涉及的分析物。

對照標準物質(zhì)

在方法驗證中，含有分析物對照標準物質(zhì)的溶液將被加入到空白生物基質(zhì)中。此外，色譜方法通常使用適當?shù)膬?nèi)標。

應(yīng)該從可追潮的來源獲得對照標準物質(zhì)，應(yīng)該科學(xué)論證對照標準物質(zhì)的適用性、分析證書應(yīng)該確認對照標準物質(zhì)的純度，并提供儲存條件、失效日期和批號。對于內(nèi)標，只要能證明其適用性即可，例如顯示該物質(zhì)本身或其相關(guān)的任何雜質(zhì)不產(chǎn)生干擾。

當在生物分析方法中使用質(zhì)譜檢測時,推薦盡可能使用穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)標，它們必須具有足夠高的同位素純度,并且不發(fā)生同位素交換反應(yīng)，以避免馜蠕幾夢鯀兩果的偏差。

1.選擇性

該分析方法應(yīng)該能夠區(qū)分目標分析物和內(nèi)標與基質(zhì)的內(nèi)源性組分或樣品中其他組分。應(yīng)該使用至少6個受試者的適宜的空白基質(zhì)來證明選擇性(動物空白基質(zhì)可以不同批次混合)，它們被分別分析并評價干擾。當干擾組分的響應(yīng)低于分析物定量下限響應(yīng)的20%,并低于內(nèi)標響應(yīng)的5%時,通常即可以接受。

應(yīng)該考察藥物代謝物、經(jīng)樣品預(yù)處理生成的分解產(chǎn)物以及可能的同服藥物引起干擾的程度。在適當情況下，也應(yīng)該評價代謝物在分析過程中回復(fù)轉(zhuǎn)化為母體分析物的可能性。

2.殘留

應(yīng)該在方法建立中考察殘留開使之最小，殘留可能不影響準確度和精密度，應(yīng)通過在注射高濃度樣品或校正標樣后,注射空白樣品來估計殘留，高濃度樣品之后在空白樣品中的殘留應(yīng)不超過定量下限的20%,并且不超過內(nèi)標的5%。如果殘留不可避免，應(yīng)考慮特殊措施,在方法驗證時檢驗并在試驗樣品分析時應(yīng)用這些措施，以確保不影響準確度和精密度。這可能包括在高濃度樣品后注射空白樣品，然后分析下一個試驗樣品。

3.定量下限

定量下限是能夠被可靠定量的樣品中分析物的最低濃度,具有可接受的準確度和精密度，定是下限是標準曲線的最低點,應(yīng)適用于預(yù)期的濃度和試驗目的。

4.標準曲線

應(yīng)該在指定的濃度范圍內(nèi)評價儀器對分析物的響應(yīng)，獲得標準曲線。通過加入已知濃度的分析物(和內(nèi)標)到空白基質(zhì)中,制備各濃度的校正標樣其基質(zhì)應(yīng)該與目標試驗樣品基質(zhì)相同。方法驗證中研究的每種分析物和每一分析批，都應(yīng)該有一條標準曲線。在進行分析方法驗證之前,最好應(yīng)該了解預(yù)期的濃度范圍。標準曲線范圍應(yīng)該盡量覆蓋預(yù)期濃度范圍，由定量下限和定量上限(校正標樣的最高濃度)來決定。該范圍應(yīng)該足夠描述分析物的藥動學(xué)。

應(yīng)該使用至少6個校正濃度水平，不包括空白樣品(不含分析物和內(nèi)標的處理過的基質(zhì)樣品)和要濃度樣品(含內(nèi)標的處理過的基質(zhì))。每個校正標樣可以被多次處理和分析。 

應(yīng)該使用簡單且足夠描述儀器對分析物濃度響應(yīng)的關(guān)系式。空白和零濃度樣品結(jié)果不應(yīng)參與計算標準曲線參數(shù)。

應(yīng)該提交標準曲線參數(shù)，測定校正標樣后回算得出的濃度應(yīng)一并提交。在方法驗證中，至少應(yīng)該評價3條標準曲線校正標樣回算的濃度一股應(yīng)該在標示值的+15%以內(nèi),定量下限處應(yīng)該在+20%內(nèi)。至少75%校正標樣,含最少6個有效濃度，應(yīng)滿足上述標準。如果某個校正標樣結(jié)果不符合這些標準,應(yīng)該拒絕這一標樣,不含這一標樣的標準曲線應(yīng)被重新評價,包括回歸分析。

最好使用新鮮配制的樣品建立標準曲線，但如果有穩(wěn)定性數(shù)據(jù)支持，也可以使用預(yù)先配制并儲存的校正標樣

5.準確度

分析方法的準確度描述該方法測得值與分析物標示濃度的接近程度,表示為:(測得值/真實值)x100%。應(yīng)采用加入已知量分析物的樣品來評估準確度，即質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品的配制應(yīng)該與校正標樣分開進行，使用另行配制的儲備液。

應(yīng)該根據(jù)標準曲線分析質(zhì)控樣品,將獲得的濃度與標示濃度對比。準確度應(yīng)報告為標示值的百分比。應(yīng)通過單一分析批(批內(nèi)準確度)和不同分析批

(批間準確度)獲得質(zhì)控樣品值來評價準確度。

為評價一個分析批中不同時間的任何趨勢，推薦以質(zhì)控樣品分析批來證明準確度，其樣品數(shù)不少于一個分析批預(yù)期的樣品數(shù)

批內(nèi)準確度

為了驗證批內(nèi)準確度，應(yīng)取一個分析批的定量下限及低、中、高濃度質(zhì)控樣品,每個濃度至少用5個樣品。濃度水平覆蓋標準曲線范圍:定量下限,在不高于定量下限濃度3倍的低濃度質(zhì)控樣品,標準曲線范圍中部附近的中濃度質(zhì)控樣品,以及標準曲線范圍上限約75%處的高濃度質(zhì)控樣品。準確度均值一般應(yīng)在質(zhì)控樣品標示值的+15%之內(nèi)，定量下限準確度應(yīng)在標示值的+20%范圍內(nèi)。

批間準確度

通過至少3個分析批，且至少兩天進行,每批用定量下限以及低、中、高濃度質(zhì)控樣品,每個濃度至少5個測定值來評價。準確度均值一股應(yīng)在質(zhì)控樣品標示值的+15%范圍內(nèi)，對于定量下限，應(yīng)在標示值的+20%范圍內(nèi)。

報告的準確度和精密度的驗證數(shù)據(jù)應(yīng)該包括所有獲得的測定結(jié)果，但是已經(jīng)記錄明顯失誤的情況除外.

6.精密度

分析方法的精密度描述分析物重復(fù)測定的接近程度,定義為測量值的相對標準差(變異系數(shù))。應(yīng)使用與證明準確度相同分析批樣品的結(jié)果，獲得在同一批內(nèi)和不同批間定量下限以及低、中、高濃度質(zhì)控樣品的精密度。

對于驗證批內(nèi)精密度,至少需要一個分析批的4個濃度,即定量下限以及低、中、高濃度,每個濃度至少5個樣品。對于質(zhì)控樣品,批內(nèi)變異系數(shù)一般不得超過15%，定量下限的變異系數(shù)不得超過20%，

對于驗證批間精密度，至少需要3個分析批(至少2天)的定量下限以及低、中、高濃度,每個濃度至少5個樣品。對于質(zhì)控樣品,批間變異系數(shù)一般不得超過15%，定量下限的變異系數(shù)不得超過20%。

7.稀釋可靠性

樣品稀釋不應(yīng)影響準確度和精密度。應(yīng)該通過向基質(zhì)中加入分析物至高于定量上限濃度,并用空白基質(zhì)稀釋該樣品(每個稀釋因子至少5個測定值)來證明稀釋的可靠性。準確度和精密度應(yīng)在+15%之內(nèi)，稀釋的可靠性應(yīng)該覆蓋試驗樣品所用的稀釋倍數(shù)。

可以通過部分方法驗證來評價稀釋可靠性。如果能夠證明其他基質(zhì)不影響精密度和準確度，也可以接受其使用,

8.基質(zhì)效應(yīng)

當采用質(zhì)潛方法時，應(yīng)該考察基質(zhì)效應(yīng)。使用至少6批來自不同供體的空白基質(zhì),不應(yīng)使用合并的基質(zhì)。如果基質(zhì)難以獲得,則使用少于6批基質(zhì),但應(yīng)該說明理由。

對千每批基質(zhì),應(yīng)該通過計算基質(zhì)存在下的峰面積(由空白基質(zhì)提取后加入分析物和內(nèi)標測得),與不含基質(zhì)的相應(yīng)峰面積(分析物和內(nèi)標的純?nèi)芤?span style="font-size: 16px; font-family: Calibri;">)比值，計算每一分析物和內(nèi)標的基質(zhì)因子。進一步通過分析物的基質(zhì)因子除以內(nèi)標的基質(zhì)因子,計算經(jīng)內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子。從6批基質(zhì)計算的內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)不得大于15%。該測定應(yīng)分別在低濃度和高濃度下進行。

如果不能適用上述方式，例如采用在線樣品預(yù)處理的情況,則應(yīng)該通過分析至少6批基質(zhì),分別加入高濃度和低濃度(定量下限濃度3倍以內(nèi)以及接近定量上限)，來獲得批間響應(yīng)的變異，其驗證報告應(yīng)包括分析物和內(nèi)標的峰面積,以及每一樣品的計算濃度，這些濃度計算值的總體變異系數(shù)不得大于15%。

除正常基質(zhì)外，還應(yīng)關(guān)注其他樣品的基質(zhì)效應(yīng)，例如溶血的或高血脂的血漿樣品等。

9.穩(wěn)定性

必須在分析方法的每一步驟確保穩(wěn)定性,用于檢査穩(wěn)定性的條件,例如樣品基質(zhì)、抗凝劑、容器材料、儲存和分析條件,都應(yīng)該與實際試驗樣品的條件相似。用文獻報道的數(shù)據(jù)證明穩(wěn)定性是不夠的，

采用低和高濃度質(zhì)控樣品(空白基質(zhì)加入分析物至定量下限濃度3倍以內(nèi)以及接近定量上限),在預(yù)處理后以及在所評價的條件儲存后立即分析。由新鮮制備的校正標樣獲得標準曲線，根據(jù)標準曲線分析質(zhì)控樣品,將測得濃度與標示濃度相比較,每一濃度的均值與標示濃度的偏差應(yīng)在+15%范圍內(nèi)。

應(yīng)通過適當稀釋，考慮到檢測器的線性和測定范圍，檢驗儲備液和工作溶液的穩(wěn)定性。

穩(wěn)定性檢查應(yīng)考察不同儲存條件，時間尺度應(yīng)不小于試驗樣品儲存的時間。

通常應(yīng)該進行下列穩(wěn)定性考察。

(1)分析物和內(nèi)標的儲備液和工作溶液的穩(wěn)定性,

(2)從冰箱儲存條件到室溫或樣品處理溫度,基質(zhì)中分析物的冷凍和融化穩(wěn)定性,

(3)基質(zhì)中分析物在冰箱儲存的長期穩(wěn)定性。

此外，如果適用，也應(yīng)該進行下列考察。

(4)處理過的樣品在室溫下或在試驗過程儲存條件下的穩(wěn)定性,

(5)處理過的樣品在自動進樣器溫度下的穩(wěn)定性

在多個分析物試驗中，特別是對于生物等效性試驗，應(yīng)該關(guān)注每個分析物在含所有分析物基質(zhì)中的穩(wěn)定性應(yīng)特別關(guān)注受試者采血時,以及在儲存前預(yù)處理的基質(zhì)中分析物的穩(wěn)定性,以確保由分析方法獲得的濃度反映受試者采樣時刻的分析物濃度?？赡苄?/span>要根據(jù)分析物的結(jié)構(gòu)，按具體情況證明其穩(wěn)定性，

(二)部分驗證

在對已被驗證的分析方法進行小幅改變情況下，根據(jù)改變的實質(zhì)內(nèi)容，可能需要部分方法驗證，可能的改變包括:生物分析方法轉(zhuǎn)移到另一個實驗室，改變儀器、校正濃度范圍、樣品體積，其他基質(zhì)或物種，改變抗凝劑、樣品處理步驟、儲存條件等。應(yīng)報告所有的改變，并對重新驗證或部分驗證的范圍說明理由，

(三)交叉驗證

應(yīng)用不同方法從一項或多項試驗獲得數(shù)據(jù)，或者應(yīng)用同一方法從不同試驗地,點獲得數(shù)據(jù)時,需要互相比較這些數(shù)據(jù)時,需要進行分析方法的交叉驗證。如果可能，應(yīng)在試驗樣品被分析之前進行交叉驗證,同一系列質(zhì)控樣品或試驗樣品應(yīng)被兩種分析方法測定。對于質(zhì)控樣品,不同方法獲得的平均準確度應(yīng)在+15%范圍內(nèi),如果放寬,應(yīng)該說明理由。對于試驗樣品,至少67%樣品測得的兩組數(shù)值差異應(yīng)在兩者均值的+20%范圍內(nèi)。

三、試驗樣品分析

在分析方法驗證后，可以進行試驗樣品或受試者樣品分析。需要在試驗樣品分析開始前證實生物分析方法的效能,應(yīng)根據(jù)已驗證的分析方法處理試驗樣品以及質(zhì)控樣品和校正標樣，以保證分析批被接受。

(一)分析批

一個分析批包括空白樣品和零濃度樣品,包括至少6個濃度水平的校正標樣，至少3個濃度水平質(zhì)控樣品(低、中、高濃度雙重樣品，或至少試驗樣品總數(shù)的5%,兩者中取數(shù)目更多者),以及被分析的試驗樣品。所有樣品(校正標樣、質(zhì)控和試驗樣品)應(yīng)按照它們將被分析的順序，在同一樣品批中被處理和提取。一個分析批包括的樣品在同一時間處理,即沒有時間間隔,由同一分析者相繼處理,使用相同的試劑，保持一致的條件。質(zhì)控樣品應(yīng)該分散到整個批中，以此保證整個分析批的準確度和精密度，對于生物等效性試驗，建議一名受試者的全部樣品在同一分析批中分析，以減少結(jié)果的變異

(二)分析批的接受標準

應(yīng)在分析試驗計劃或標準操作規(guī)程中，規(guī)定接受或拒絕一個分析批的標準，在整個分析批包含多個部分批次的情況，應(yīng)該針對整個分析批，也應(yīng)該針對分析批中每一部分批次樣品定義接受標準。應(yīng)該使用下列接受標準。

校正標樣測定回算濃度一般應(yīng)在標示值的+15%范圍內(nèi)，定量下限應(yīng)在+20%范圍內(nèi)。不少于6個校正標樣,至少75%標樣應(yīng)符合這些標準。如果校正標樣中有一個不符合標準，則應(yīng)該拒絕這個標樣,重新計算不含該標樣的標準曲線，并進行回歸分析。

質(zhì)控樣品的準確度值應(yīng)該在標示值的±15%范圍內(nèi)。至少67%質(zhì)控樣品,且每一濃度水平至少50%樣品應(yīng)符合這一標準。在不滿足這些標準的情況下，應(yīng)該拒絕該分析批，相應(yīng)的試驗樣品應(yīng)該重新提取和分析。

在同時測定幾個分析物的情況下,對每個分析物都要有一條標準曲線。如果一個分析批對于一個分析物可以接受,而對于另一個分析物不能接受,則接受的分析物數(shù)據(jù)可以被使用，但應(yīng)該重新提取和分析樣品，測定被拒絕的分析物。

如果使用多重校正標樣，其中僅一個定量下限或定量上限標樣不合格，則校正范圍不變

所有接受的分析批，每個濃度質(zhì)控樣品的平均準確度和精密度應(yīng)該列表，并在分析報告中給出。如果總平均準確度和精密度超過15%,則需要進行額外的考察，說明該偏差的理由。在生物等效性試驗情況下，這可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)被拒絕。

(三)校正范圍

如果在試驗樣品分析開始前，已知或預(yù)期試驗樣品中的分析物濃度范圍窄,則推薦縮窄標準曲線范圍,調(diào)整質(zhì)控樣品濃度，或者適當加入質(zhì)控樣品新的濃度，以充分反映試驗樣品的濃度。

如果看起來很多試驗樣品的分析物濃度高于定量上限,在可能的情況下,應(yīng)該延伸標準曲線的范圍,加入額外濃度的質(zhì)控樣品或改變其濃度,至少2個質(zhì)控樣品濃度應(yīng)該落在試驗樣品的濃度范圍內(nèi)。如果標準曲線范圍被改變，則生物分析方法應(yīng)被重新驗證(部分驗證),以確認響應(yīng)函數(shù)并保證準確度和精密度。

(四)試驗樣品的重新分析和報告值選擇

應(yīng)該在試驗計劃或標準操作規(guī)程中預(yù)先確定重新分析試驗樣品的理由以及選擇報告值的標準，在試驗報告中應(yīng)該提供重新分析的樣品數(shù)目以及占樣品總數(shù)的比例。

重新分析試驗樣品可能基于下列理由

(1)由于校正標樣或質(zhì)控樣品的準確度或精密度不符合接受標準,導(dǎo)致一個分析批被拒絕(2)內(nèi)標的響應(yīng)與校正標樣和質(zhì)控樣品的內(nèi)標響應(yīng)差異顯著。

(3)進樣不當或儀器功能異常。

(4)測得的濃度高于定量上限,或低于該分析批的定量下限,且該批的最低濃度標樣從標準曲線中被拒絕,導(dǎo)致比其他分析批的定量下限高.(5)在給藥前樣品或安慰劑樣品中測得可定量的分析物

(6)色譜不佳。

對于生物等效性試驗，通常不能接受由于藥動學(xué)理由重新分析試驗樣品，在由于給藥前樣品陽性結(jié)果或者由于藥動學(xué)原因進行重新分析的情況下,應(yīng)該提供重新分析樣品的身份、初始值、重新分析的理由、重新分析獲得值、最終接受值以及接受理由。

在儀器故障的情況下，如果已經(jīng)在方法驗證時證明了重新進樣的重現(xiàn)性和進樣器內(nèi)穩(wěn)定性,則可以將已經(jīng)處理的樣品重新進樣。但對于拒絕的分析批，則需要重新處理樣品。

(五)色譜積分

應(yīng)在標準操作規(guī)程中描述色譜的積分以及重新積分。任何對該標準操作規(guī)程的偏離都應(yīng)在分析報告中討論。實驗室應(yīng)該記錄色譜積分參數(shù),在重新積分的情況下，記錄原始和最終的積分數(shù)據(jù)，并在要求時提交。

(六)用于評價方法重現(xiàn)性的試驗樣品再分析

在方法驗證中使用校正標樣和質(zhì)控樣品可能無法模擬實際試驗樣品。例如，蛋白結(jié)合、已知和未知代謝物的回復(fù)轉(zhuǎn)化、樣品均一性或同服藥物引起的差異，可能影響這些樣品在處理和儲存過程中分析物的準確度和精密度。因此，推薦通過在不同天后，在另外一個分析批中重新分析試驗樣品，來語價實際樣品測定的準確度。檢驗的范圍由分析物和試驗樣品決定，并應(yīng)該基于對分析方法和分析物的深入理解。建議獲得c……附近和消除相樣品的結(jié)果，一般應(yīng)該重新分析10%樣品，如果樣品總數(shù)超過1000，則超出部分重新分析5%樣品,對于至少67%的重復(fù)測試，原始分析測得的濃度和重新分析測得的濃度之間的差異應(yīng)在兩者均值的+20%范圍內(nèi)。試驗樣品再分析顯示偏差結(jié)果的情況下，應(yīng)該進行考察，采取足夠的步驟優(yōu)化分析方法。至少在下列情形下，應(yīng)該進行試驗樣品的再分析，

(1)毒動學(xué)試驗，每個物種一次。

(2)所有關(guān)鍵性的生物等效性試驗。

(3)首次用于人體的藥物試驗。

(4)首次用于患者的藥物試驗。

(5)首次用于肝或腎功能不全患者的藥物試驗。

對于動物試驗，可能僅需要在早期關(guān)鍵性試驗中進行實際樣品的再分析，例如涉及給藥劑量和測得濃度關(guān)系的試驗。

四、配體結(jié)合分析

配體結(jié)合分析主要用于大分子藥物。前述的驗證原則以及對試驗樣品分析的考慮一般也適用。但是由于大分子固有的特點和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，使其難以被提取，所以常常在無預(yù)先分離的情況下測定分析物。此外,方法的檢測終點并不直接來自分析物的響應(yīng),而來自與其他結(jié)合試劑產(chǎn)生的間接信號。配體結(jié)合分析中，每個校正標樣、質(zhì)控樣品以及待測樣品一般都采用復(fù)孔分析。如無特殊說明，本節(jié)以雙孔分析為原則。

（一）方法驗證前的考量

1.標準品選擇

生物大分子具有不均一性，其中成分的效價與免疫反應(yīng)可能存在差異。因此應(yīng)對標準品進行充分表征。應(yīng)盡量使用純度最高的標準品。用于配制校正標樣和質(zhì)控樣品的標準品應(yīng)盡量與臨床和非臨床試驗使用的受試品批號相同，標準品批號變更時，應(yīng)盡量對其進行表征和生物分析評價，以確保方法性能不變。

2.基質(zhì)選擇

般不推薦使用經(jīng)碳吸附、免疫吸附等方法提取過的基質(zhì),或透析血清、蛋白緩,中液等替代實際樣品基質(zhì)建立分析方法。但在某些情況下，復(fù)雜生物基質(zhì)中可能存在高濃度與分析物結(jié)構(gòu)相關(guān)的內(nèi)源性物質(zhì),其高度干擾導(dǎo)致根本無法測定分析物，在無其他可選定量策略的前提下，可允許使用替代基質(zhì)建立分析方法。但應(yīng)對使用替代基質(zhì)建立方法的必要性加以證明，

可采用替代基質(zhì)建立標準曲線，但質(zhì)控樣品必須用實際樣品基質(zhì)配制，應(yīng)通過計算準確度來證明基質(zhì)效應(yīng)的消除

3.最低需求稀釋度的確定

分析方法建立與驗證過程中，可能需要對基質(zhì)進行必要的稀釋,以降低其產(chǎn)生的高背景信號。在此情況下，應(yīng)考察最低需求稀釋度。它是指分析方法中為提高信噪比、減少基質(zhì)干擾、優(yōu)化準確度與精密度而必須使用緩,中液對生物樣品進行稀釋的最小倍數(shù)。應(yīng)使用與試驗樣品相同的基質(zhì)來配制加藥樣品來確定最低需求稀釋度。

4.試劑

方法的關(guān)鍵試劑，如結(jié)合蛋白、適配子、抗體或偶聯(lián)抗體、酶等,對分析結(jié)果會產(chǎn)生直接影響,因此須確保質(zhì)量。如果在方法驗證或樣品分析過程中，關(guān)鍵試劑批次發(fā)生改變，須確認方法性能不因此改變，從而確保不同批次結(jié)果的一致性,

無論是關(guān)鍵試劑，還是緩沖液、稀釋液、酸化劑等非關(guān)鍵試劑,都應(yīng)對維持其穩(wěn)定性的保障條件進行記錄,以確保方法性能長期不變

(二) 方法驗證

1.完整驗證

(1)標準曲線與定量范圍標準曲線反映了分析物濃度與儀器響應(yīng)值之間的關(guān)系。在配體結(jié)合分析方法中,標準曲線的響應(yīng)函數(shù)是間接測得的,一般呈非線性，常為S形曲線。

應(yīng)使用至少6個有效校正標樣濃度建立標準曲線。校正標樣應(yīng)在預(yù)期定量范圍對數(shù)坐標上近似等距離分布。除校正標樣外,可使用錨定點輔助曲線擬臺

驗證過程中，須至少對6個獨立的分析批進行測定，結(jié)果以列表形式報告，以確定標準曲線回歸模型整體的穩(wěn)健性。擬合時,一條標曲允許排除由于明確或不明原因產(chǎn)生失誤的濃度點，排除后應(yīng)至少有75%的校正標樣回算濃度在標示值的+20%(定量下限與定量上限在±25%)范圍內(nèi)。定量下限與定量上限之間的濃度范圍為標準曲線的定量范圍，錨定點校正樣品是處于定量范圍之外的標樣點,用于輔助擬合配體結(jié)合分析的非線性回歸標準曲線

因其在定量范圍之外，可不遵循上述接受標準，

(2)特異性 特異性是指在樣品中存在相關(guān)干擾物質(zhì)的情況下,分析方法能夠準確、專一地測定分析物的能力。結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)或預(yù)期合用藥物應(yīng)不影響方法對分析物的測定。如在方法建立與驗證階段無法獲取結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì),特異性評價可在最初方法驗證完成后補充進行。應(yīng)采用未曾暴露于分析物的基質(zhì)配制高濃度與低濃度質(zhì)控樣品,加入遞增濃度的相關(guān)干擾物質(zhì)或預(yù)期合用藥物進行特異性考察。未加入分析物的基質(zhì)也應(yīng)同時被測量。要求至少80%以上的質(zhì)控樣品準確度在+20%范圍內(nèi)(如果在定量下限水平,則在+25%范圍內(nèi)),目未加入分析物的基質(zhì)的測量值應(yīng)低于定量下限。

(3)選擇性方法的選擇性是指基質(zhì)中存在非相關(guān)物質(zhì)的情況下,準確測定分析物的能力。由于生物大分子樣品一般不經(jīng)提取，基質(zhì)中存在的非相關(guān)物質(zhì)可能會干擾分析物的測定。應(yīng)通過向至少10個不同來源的基質(zhì)加入定量下限和定量上限水平的分析物來考察選擇性，也,應(yīng)同時測量未加入分析物的基質(zhì)，選擇性考察要求至少80%以上的樣品準確度在+20%范圍內(nèi)(如果在定量下限水平,則在+25%范圍內(nèi)),日未加入分析物的其質(zhì)的測是值應(yīng)低于定量下限。如果干擾具有濃度依賴件,則須測定發(fā)生干擾的最低濃度。在此情況下,可能需要在方法驗證之前調(diào)整定量下限，根據(jù)項目需要，可能需要針對病人群體基質(zhì)或特殊基質(zhì)(如溶血基質(zhì)或高血脂基質(zhì))考察選擇性。

(4)精密度與淮確度 應(yīng)選擇至少5個濃度的質(zhì)控樣品進行準確度、精密度以及方法總誤差考察，包括定量下限濃度、低濃度質(zhì)控(定量下限濃度的3倍以內(nèi))、中濃度質(zhì)控(標準曲線中段)、高濃度質(zhì)控(定量上限濃度75%以上)以及定量上限濃度質(zhì)控。低、中、高濃度質(zhì)控標示值不得與校正標樣濃度標示值相同，質(zhì)控樣品應(yīng)經(jīng)過冷凍，并與試驗樣品采用相同的方法進行處理，不建議采用新鮮配制的質(zhì)控樣品進行精密度與準確度考察。批間考察應(yīng)在數(shù)日內(nèi)進行至少6個獨立的分析批測定。每批內(nèi)應(yīng)包含至少3套質(zhì)控樣品(每套含至少5個濃度的質(zhì)控樣品)。對于批內(nèi)和批間準確度,各濃度質(zhì)控樣品的平均濃度應(yīng)在標示值的+20%(定量下限和定量上限為+25%)范圍內(nèi)。批內(nèi)和批間精密度均不應(yīng)超過20%(定量下限和定量上限為25%)。此外，方法總誤差(即%相對偏差絕對值與%變異系數(shù)之和)不應(yīng)超過30%(定量下限和定量上限為40%)。

(5)稀釋線性在標準曲線定量范圍不能覆蓋預(yù)期樣品濃度的情況下,應(yīng)使用質(zhì)控樣品進行方法的稀釋線性考察,即評價樣品濃度超過分析方法的定量上限時，用空白基質(zhì)將樣品濃度稀釋至定量范圍內(nèi)后,方法能否準確測定，進行稀釋實驗的另一目的是考察方法是否存在"前帶"或"鉤狀"效應(yīng),即高濃度分析物引起的信號抑制。

稀釋線性考察中，稀釋至定量范圍內(nèi)的每個0C樣品經(jīng)稀釋度校正后的回算濃度應(yīng)在標示值的+20%范圍內(nèi)，目所有OC樣品回算終濃度的精密度不超過20%.

(6)平行性為發(fā)現(xiàn)可能存在的基質(zhì)效應(yīng),或代謝物的親和性差異,在可獲得真實試驗樣品的情況下,應(yīng)考慮對標準曲線和系列稀釋的試驗樣品之間進行平行性考察。應(yīng)選取高濃度試驗樣品(最好采用超出定量上限的樣品)，用空白基質(zhì)將其稀釋到至少3個不同濃度后進行測定,系列稀釋樣品間的精密度不應(yīng)超過30%，如果存在樣品稀釋非線件的情況(即非平行件),則應(yīng)按事先的規(guī)定予以報告，如果在方法驗證期間無法獲取直實試驗樣品則應(yīng)在獲得真實試驗樣品后盡快進行平行性考察。

(7)樣品穩(wěn)定性 應(yīng)使用低、高濃度質(zhì)控樣品考察分析物的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性考察應(yīng)包括室溫或樣品處理溫度下的短期穩(wěn)定性,以及凍-融穩(wěn)定性。此外，如果試驗樣品需要長期凍存,則應(yīng)在可能凍存樣品的每個溫度下進行長期穩(wěn)定性考察，每一濃度質(zhì)控樣品應(yīng)有67%以上的樣品濃度在標示值的±20%范圍內(nèi)。

(8)商品化試劑盒，商品化試劑盒可以用來進行試驗樣品分析，但使用前必須按本指導(dǎo)原則的要求對其進行驗證

2.部分驗證和交叉驗證

在二、(二)和二、(三)中敘述的關(guān)于驗證的各項內(nèi)容都適用于配體結(jié)合分析。

(三)試驗樣品分析

1.分析批

配體結(jié)合分析中最常使用微孔板，一個微孔板通常為一個分析批。每個微孔板應(yīng)包含一套獨立的標準曲線和質(zhì)控樣品，以校準板間差異。在使用某些平臺時，單個樣品載體的通量可能有限,此時允許一個分析批包含多個載體?？稍谠摲治雠氖讉€與未個載體各設(shè)置一套標準曲線,同時在每一載體上設(shè)置質(zhì)控樣品。所有樣品均應(yīng)復(fù)孔測定，

2.試驗樣品分析的接受標準

對于每個分析批，除錨定點外，標準曲線須有75%以上的校正標樣(至少6個)回算濃度在標示值的+20%(定量下限和定量上限為+25%)范圍內(nèi),。每塊板應(yīng)含有至少2套3水平(低、中、高濃度)的復(fù)設(shè)質(zhì)控樣品。在試驗樣品測試過程的驗證中,質(zhì)控樣品的復(fù)設(shè)數(shù)量應(yīng)與試驗樣品分析一致，每塊板至少67%的質(zhì)控樣品應(yīng)符合準確度在+20%范圍以內(nèi),精密度不超過20%的標準,日每一濃度水平的質(zhì)控樣品中至少50%符合上述標準,。

3.實際樣品再分析

在3.6節(jié)中關(guān)于實際樣品再分析的所有論述均適用于配體結(jié)合分析。再分析樣品的接受標準為初測濃度與復(fù)測濃度都在二者均值的±30%范圍內(nèi)，再分析樣品中至少67%以上應(yīng)符合該接受標準。

五、試驗報告

(一)方法驗證報告

如果方法驗證報告提供了足夠詳細的信息,則可以引用主要分析步驟的標準操作規(guī)程標題,否則應(yīng)該在報告后面附上這些標準操作規(guī)程的內(nèi)容。

全部源數(shù)據(jù)應(yīng)該以其原始格式保存，并根據(jù)要求提供。

應(yīng)該記錄任何對驗證計劃的偏離，

方法驗證報告應(yīng)該包括至少下列信息

(1)驗證結(jié)果概要。

(2)所用分析方法的細節(jié)，如果參考了已有方法，給出分析方法的來源

(3)摘要敘述分析步驟(分析物，內(nèi)標，樣品預(yù)處理、提取和分析)。

(4)對照標準品(來源，批號，分析證書，穩(wěn)定性和儲存條件)。

(5)校正標樣和質(zhì)控樣品(基質(zhì),抗凝劑,預(yù)處理,制備日期和儲存條件)。

(6)分析批的接受標準。

(7)分析批 所有分析批列表,包括校正范圍、響應(yīng)函數(shù)、回算濃度、準確度:所有接受分析批的質(zhì)控樣品結(jié)果列表;儲備液、工作溶液、質(zhì)控在所用儲存條件下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù);選擇性、定量下限、殘留、基質(zhì)效應(yīng)和稀釋考察數(shù)據(jù)。

8)方法驗證中得到的意外結(jié)果，充分說明采取措施的理由,(9)對方法或?qū)藴什僮饕?guī)程的偏離

所有測定及每個計算濃度都必須出現(xiàn)在驗證報告中。

（二）樣品分析報告

樣品分析報告應(yīng)該引用該試驗樣品分析的方法驗證報告，還應(yīng)包括對試驗樣品的詳細描述。

全部源數(shù)據(jù)應(yīng)該以其原始格式保存，并根據(jù)要求提供。

應(yīng)該在分析報告中討論任何對試驗計劃、分析步或標準操作規(guī)程的偏離分析報告應(yīng)至少包括下列信息

(1)對照標準品

(2)校正標樣和質(zhì)控樣品的儲存條件,

(3)簡要敘述分析批的接受標準，引用特定的試驗計劃或標準操作規(guī)程。

(4)樣品蹤跡(接收日期和內(nèi)容,接收時樣品狀態(tài)，儲存地點和條件)。(5)試驗樣品分析:所有分析批和試驗樣品列表，包括分析日期和結(jié)果;所有接受的分析批的標準曲線結(jié)果列表:所有分析批的質(zhì)控結(jié)果列表,落在接受標準之外的數(shù)值應(yīng)該清楚標出。

(6)失敗的分析批數(shù)目和日期

(7)對方法或標準操作規(guī)程的偏離,

(8)重新分析結(jié)果。

試驗樣品再分析的結(jié)果可以在方法驗證報告、樣品分析報告或者在單獨的報告中提供對于生物等效性試驗等，應(yīng)在樣品分析報告之后按規(guī)定附上受試者分析批的全部色譜圖,包括相應(yīng)的質(zhì)控樣品和校正標樣的色譜圖,