一、概述

重組腺相關病毒（ Recombinant adeno-associatedvirus，rAAV）載體因理化性質穩(wěn)定，致病性、整合風險低，外源基因表達持久等特點，成為基因治療領域內重要的病毒載體之一。rAAV 產(chǎn)品創(chuàng)新程度較高，生產(chǎn)工藝復雜多樣，質量研究和控制方法發(fā)展迅速，監(jiān)管和業(yè)界對 rAAV 產(chǎn)品生產(chǎn)工藝和質量研究等方面的認知仍處于不斷探索和完善中。本文根據(jù)現(xiàn)階段的科學認知、行業(yè)實踐和經(jīng)驗積累，對不同生產(chǎn)工藝的外源病毒因子風險控制策略、質量研究和質量標準制定過程中的共性問題提出一般性技術要求，以供申請人/持有人參考。本文件僅反映監(jiān)管部門當前對 rAAV 產(chǎn)品生產(chǎn)工藝和質量研究相關共性問題的一般要求，隨著科學技術的發(fā)展和監(jiān)管經(jīng)驗的積累，相關內容將不斷完善與更新。

二、常見問題與技術要求

（一）外源病毒因子風險控制的一般要求

目前 rAAV 產(chǎn)品生產(chǎn)工藝類型多樣，不同類型生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的 rAAV 產(chǎn)品，可能引入的病毒污染風險程度不同，因而外源病毒因子控制策略有所不同。因此，建議深入分析不同生產(chǎn)工藝病毒污染的潛在來源，并根據(jù)工藝特點、產(chǎn)品特點采用多階段控制策略以控制整體風險。

1、情形一：采用瞬時轉染細胞系或穩(wěn)定轉化細胞系生產(chǎn)的rAAV 產(chǎn)品采用瞬時轉染細胞系或穩(wěn)定轉化細胞系生產(chǎn)的 rAAV 產(chǎn)品，病毒污染的風險可能來自細胞系（即生產(chǎn)用細胞），生產(chǎn)過程中使用的動物/人源生產(chǎn)用原材料，也可能來自生產(chǎn)過程中的偶然引入。因此，該情形下的 rAAV 產(chǎn)品外源病毒因子風險控制策略建議如下：

（1）細胞庫方面，建議按照 ICH Q5A（R2）、《中國藥典》等相關技術指南要求對主細胞庫、工作細胞庫、生產(chǎn)終末細胞或生產(chǎn)限定代次細胞進行檢定，結合細胞來源、傳代或改造歷史、建庫過程中使用的原材料情況等進行風險評估后確定外源病毒因子檢測種類。

（2）動物/人源生產(chǎn)用原材料方面，應結合其來源、生產(chǎn)工藝等開展特異性外源病毒因子檢測，外源病毒因子檢測種類應全面，檢測方法應足夠靈敏。

（3）生產(chǎn)工藝控制方面，建議選擇適宜的生產(chǎn)步驟進行工藝過程中外源病毒因子的風險控制，并設立合理的驗收標準。通常選擇未加工收獲液作為檢測樣品，具體檢測方法可參考 ICH Q5A（R2）、《中國藥典》等相關技術指南的要求。

（4）病毒清除驗證方面，根據(jù)上述（1）-（3）檢測結果，如果在細胞庫檢定和未加工收獲液中未發(fā)現(xiàn)除 rAAV 以外的其他病毒、病毒樣顆粒（Virus-like particles, VLP）或逆轉錄病毒樣顆粒（Retrovirus-like particle, RVLP），則建議使用非特異“模型”病毒開展病毒去除/滅活驗證，評估現(xiàn)有生產(chǎn)工藝步驟對非特異“模型”病毒的清除能力。同時，如果在細胞庫檢定和未加工收獲液中未檢出 RVLP，且PERT 檢測結果為陰性，則不需要進一步評估每個劑量中逆轉錄病毒顆粒量。反之，如果在細胞庫檢定和未加工收獲液中發(fā)現(xiàn)除 rAAV 以外的其他病毒、VLP 或 RVLP，病毒清除驗證研究建議使用已鑒定的病毒，如果不能使用已鑒定的病毒，則應使用“相關”病毒或特異“模型”病毒開展研究。同時，還應考慮使用對物理或化學方法處理具有顯著耐受性的非特異“模型”病毒進行驗證。

（5）原液/純化后產(chǎn)品外源病毒因子檢測方面，根據(jù)上述（1）-（4）檢測結果和風險評估,如認為外源病毒因子污染風險可控，則不需要開展原液/純化后產(chǎn)品的外源病毒因子檢測。

2、情形二：采用桿狀病毒-昆蟲細胞系生產(chǎn)的 rAAV 產(chǎn)品采用桿狀病毒-昆蟲細胞系生產(chǎn)的 rAAV 產(chǎn)品，病毒污染的風險可能來自包裝/生產(chǎn)用細胞以及病毒種子批，生產(chǎn)過程中使用的動物/人源生產(chǎn)用原材料，也可能來自生產(chǎn)過程中的偶然引入。因此，該情形下的 rAAV 產(chǎn)品外源病毒因子風險控制策略建議如下：

（1）包裝/生產(chǎn)用細胞、動物/人源生產(chǎn)用原材料方面，控制要求參見情形一 “（1）-（2）”所述。

（2）病毒種子批方面，檢定應符合 ICH Q5A（R2）、《中國藥典》等相關技術指南的要求，并根據(jù)病毒種子批建立的特定情況，以及對病毒種子相關特征的評估，設定相應的檢定項目，并選擇合適的檢測方法。

（3）生產(chǎn)工藝控制方面，建議選擇適宜的生產(chǎn)步驟進行工藝過程中外源病毒因子的風險控制，并設立合理的驗收標準。通常選擇未加工收獲液作為檢測樣品，具體檢測方法可參考 ICH Q5A（R2）、《中國藥典》等相關技術指南的要求。同時，應在上市階段提供至少 3 批次商業(yè)化代表性工藝的未加工收獲液的桿狀病毒和彈狀病毒定量檢測結果，用于評估整體生產(chǎn)工藝對外源病毒因子的清除效果。

（4）病毒清除驗證方面，由于包裝/生產(chǎn)用細胞中可能含有彈狀病毒，并且生產(chǎn)體系中引入了重組桿狀病毒，因此，應考慮在生產(chǎn)工藝中設立病毒去除/滅活單元，并參考 ICHQ5A（R2）的一般原則開展病毒去除/滅活驗證研究。原則上，病毒清除驗證研究應使用已鑒定的病毒，如果不能使用已鑒定的病毒，則應使用“相關”病毒或特異“模型”病毒開展研究，如桿狀病毒和水泡性口炎病毒（可代表 sf9 細胞系中內源性彈狀病毒）。同時，還應考慮使用對物理或化學方法處理具有顯著耐受性的非特異“模型”病毒進行驗證。選擇模型病毒的種類和數(shù)量應根據(jù)包裝/生產(chǎn)用細胞質量和特性，以及生產(chǎn)工藝綜合考慮，一般建議使用至少 3 種不同特性的病毒對工藝的病毒清除能力進行評估。建議評價特定的工藝步驟對特異或非特異“模型”病毒的去除/滅活效果，并評估整體生產(chǎn)工藝步驟對特異“模型”病毒的總體清除效果。常見的病毒去除/滅活步驟通常包括溶劑/去污劑處理、低 pH 孵育、柱層析、納濾等，建議基于風險評估考慮采用多種不同原理的病毒去除/滅活工藝步驟。

（5）原液/純化后產(chǎn)品外源病毒因子檢測方面，根據(jù)上述情形二“（1）-（3）”檢測和控制，以及情形二“（4）”對“相關”病毒或特異“模型”病毒的清除能力和效果，開展充分的風險評估，如認為外源病毒因子污染風險可控，則建議上市申請時，提供至少 3 批次商業(yè)化代表性工藝的原液/純化后產(chǎn)品的殘留重組桿狀病毒和彈狀病毒檢測結果，檢測方法應選擇特異性和靈敏度較高的合適方法,并進行充分的方法學驗證。在沒有充分的證據(jù)證明生產(chǎn)工藝對“相關”病毒或特異“模型”病毒具有穩(wěn)健的清除能力和效果的情況下，應對每個批次原液/純化后產(chǎn)品進行桿狀病毒和彈狀病毒殘留的檢測。

3、情形三：采用腺病毒、單純皰疹病毒等輔助病毒生產(chǎn)的rAAV 產(chǎn)品采用腺病毒、單純皰疹病毒等輔助病毒生產(chǎn)的 rAAV 產(chǎn)品，病毒污染的風險可能來自包裝/生產(chǎn)用細胞以及病毒種子批，生產(chǎn)過程中使用的動物/人源生產(chǎn)用原材料，也可能來自生產(chǎn)過程中的偶然引入。因此，該情形下的 rAAV 產(chǎn)品外源病毒因子風險控制策略建議如下：

（1）包裝/生產(chǎn)用細胞、動物/人源生產(chǎn)用原材料方面，控制要求參見情形一 “（1）-（2）”所述。

（2）病毒種子批檢定方面，控制要求參見情形二“（2）”所述。

（3）生產(chǎn)工藝控制方面，建議選擇適宜的生產(chǎn)步驟進行工藝過程中外源病毒因子的風險控制，并設立合理的驗收標準。通常選擇未加工收獲液作為檢測樣品，具體檢測方法可參考 ICH Q5A（R2）、《中國藥典》等相關技術指南的要求。同時，應在上市階段提供至少 3 批次商業(yè)化代表性工藝的未加工收獲液的輔助病毒定量檢測結果，用于評估整體生產(chǎn)工藝對外源病毒因子的清除效果。

（4）病毒清除驗證方面，由于生產(chǎn)過程中使用了輔助病毒，因此，應考慮在生產(chǎn)工藝中設立病毒去除/滅活單元，并參考 ICH Q5A（R2）的一般原則開展病毒去除/滅活驗證研究。原則上，病毒清除驗證研究應使用已鑒定的病毒，如果不能使用已鑒定的病毒，則應使用“相關”病毒或特異“模型”病毒開展研究，如腺病毒、皰疹病毒等。同時，還應考慮使用對物理或化學方法處理具有顯著耐受性的非特異“模型”病毒進行驗證。選擇模型病毒的種類和數(shù)量應根據(jù)包裝/生產(chǎn)用細胞質量和特性，以及生產(chǎn)工藝綜合考慮，一般建議使用至少 3 種不同特性的病毒對工藝的病毒清除能力進行評估。建議評價特定的工藝步驟對特異性或非特異“模型”病毒的去除/滅活效果，并評估整體生產(chǎn)工藝步驟對特異“模型”病毒的總體清除效果。常見的病毒去除/滅活步驟通常包括溶劑/去污劑處理、低 pH 孵育、柱層析、納濾等，建議基于風險評估考慮采用多種不同原理的病毒去除/滅活工藝步驟。

（5）原液/純化后產(chǎn)品外源病毒因子檢測方面，根據(jù)上述情形三“（1）-（3）”全面檢測和控制，以及情形三“（4）”對“相關”病毒或特異“模型”病毒的清除能力和效果，開展充分的風險評估，如認為外源病毒因子污染風險可控，則建議上市申請時，提供至少 3 批次商業(yè)化代表性工藝的原液/純化后產(chǎn)品的殘留輔助病毒檢測結果，檢測方法應選擇特異性和靈敏度高的合適方法,并進行充分的方法學驗證。在沒有充分的證據(jù)證明生產(chǎn)工藝對“相關”病毒或特異“模型”病毒具有穩(wěn)健的清除能力和效果的情況下，應對每個批次的原液/純化后產(chǎn)品進行殘留輔助病毒的檢測。

（二）純度檢測方法選擇和標準限度制定的一般要求

1.rAAV 產(chǎn)品純度檢測方法選擇的一般要求CE-SDS 方法和 SDS-PAGE 方法均可用于 rAAV 產(chǎn)品的純度控制，以上方法是基于在變性條件下蛋白與 SDS 結合形成帶負電的蛋白質-SDS 復合物，這些復合物在電場作用下根據(jù)分子量大小進行分離，是目前蛋白質純度檢測比較常見的方法。

其中，CE-SDS 方法在分離度、精密度、耐用性等方面優(yōu)于 SDSPAGE 方法。隨著技術的不斷發(fā)展和進步，新的更優(yōu)的檢測方法也可能逐步應用，因此，鼓勵優(yōu)先采用精密度和準確度較高的檢測方法用于產(chǎn)品純度檢測。臨床試驗推進過程中，純度檢測方法可能隨著檢測技術的發(fā)展發(fā)生變更。如在臨床期間發(fā)生純度檢測方法的變更，建議盡可能在早期臨床試驗階段進行方法變更，同時根據(jù)方法變更情況評估風險，開展必要的變更后方法的確認或驗證，并開展變更前后方法的橋接對比研究，應確保變更后方法對產(chǎn)品質量的控制能力與變更前方法相當或更優(yōu)。變更前后方法檢測結果存在差異時，建議盡可能采用變更后方法對既往臨床試驗用代表性批次及穩(wěn)定性研究代表性批次進行重新檢測，積累批次數(shù)據(jù)，為質量標準制定提供依據(jù)。

2.rAAV 產(chǎn)品單體和聚集體含量質量控制的一般要求rAAV 產(chǎn)品單體和聚集體含量可反映生產(chǎn)工藝的穩(wěn)健性和產(chǎn)品質量特性，因此，建議開展 rAAV 產(chǎn)品單體和聚集體的質量研究，并納入質量標準。目前用于檢測 rAAV 產(chǎn)品單體和聚集體的方法較多，比如 SEC-HPLC/MALS、AUC、DLS 等，各種方法具有各自不同的特點，考慮到早期研發(fā)階段對產(chǎn)品的認知尚淺，建議盡可能采用多種技術手段或方法對產(chǎn)品單體和聚集體開展全面的表征研究。臨床試驗階段建議監(jiān)測各批次單體和聚集體的數(shù)據(jù)，以及穩(wěn)定性期間數(shù)據(jù)的變化情況，以合理擬定單體和聚集體的標準限度。

3.rAAV 產(chǎn)品特征性衣殼蛋白（VP1、VP2、VP3）控制策略的一般要求rAAV 產(chǎn)品中，VP1、VP2、VP3 含量差異較大，通常 VP1和 VP2 含量較低，VP3 含量較高，其中某些血清型的 rAAV 產(chǎn)品含有部分 VP3 分子變體，因此，建議結合產(chǎn)品特點、分子設計、受工藝影響的程度以及對安全性、有效性、質量可控性的影響程度等，綜合考慮制定特征性衣殼蛋白（VP1、VP2、VP3）以及 VP3 分子變體的控制策略。必要時，除了對 rAAV產(chǎn)品 VP1+VP2+VP3 總量進行控制外，還應結合 VP3 變體對病毒結構或功能影響的風險評估，對 VP3 分子變體含量進行單獨控制。

（三）基因組滴度檢測方法選擇和不同方法橋接對比研究的一般要求

1.rAAV 產(chǎn)品基因組滴度檢測方法選擇的一般要求

目前 rAAV 產(chǎn)品基因組滴度檢測方法常見 qPCR 和d(d)PCR 方法，其中，d(d)PCR 方法相比 qPCR 方法是對基因拷貝數(shù)的絕對定量，不依賴標準品和標準曲線，具有較好的精密度和準確度。隨著技術的不斷發(fā)展和進步，新的更優(yōu)的檢測方法也可能逐步應用，因此，鼓勵優(yōu)先采用精密度和準確度較高的檢測方法用于產(chǎn)品基因組滴度檢測。

2.不同的基因組滴度檢測方法橋接對比研究的一般要求臨床試驗推進過程中，基因組滴度檢測方法可能隨著檢測技術的發(fā)展隨之發(fā)生變更。鑒于基因組滴度對于確保產(chǎn)品劑量準確性及安全性至關重要，如發(fā)生方法學變更，建議盡可能在早期臨床試驗階段進行方法變更，同時根據(jù)方法變更情況綜合評估風險，開展必要的變更后方法的確認或驗證，并對變更前后方法進行橋接研究，應確保變更后方法對產(chǎn)品質量的控制能力與變更前方法相當或更優(yōu)，以確保臨床使用劑量的準確性。

以目前常見的兩種基因組滴度檢測方法為例，由于 qPCR方法和 d(d)PCR 方法在檢測原理、引物設計等方面存在差異，不同檢測方法的檢測結果可能存在差異，建議盡可能采用變更后方法對既往臨床試驗用代表性批次及穩(wěn)定性研究代表性批次進行重新檢測，積累批次數(shù)據(jù)，為質量標準制定提供依據(jù)。

（四）空殼率檢測方法選擇和標準限度制定的一般要求

1.rAAV 產(chǎn)品空殼率檢測方法的一般要求

目前 rAAV 產(chǎn)品常見的空殼率檢測方法包括 AUC 方法、IE-HPLC 方法、SEC-MALS 方法等。IE-HPLC 方法和 SEC-MALS方法平臺成熟，分析速度快，通量高，但可能無法完全區(qū)分部分包裝病毒和完整包裝病毒。相比 IE-HPLC、SEC-MALS 方法，AUC 法對完整包裝病毒、部分包裝病毒和空殼病毒的分離效果較好，實測空殼率與理論空殼率差異較小，目前也被行業(yè)廣泛認可和應用。隨著技術的不斷發(fā)展和進步，新的更優(yōu)的檢測方法也可能逐步應用，因此，鼓勵優(yōu)先采用精密度和準確度較高的檢測方法用于空殼率檢測和控制。

2.rAAV 產(chǎn)品空殼率標準限度制定的一般要求

建議基于產(chǎn)品特點、生產(chǎn)工藝和既往歷史批次檢測數(shù)據(jù)、給藥方式和劑量，以及與臨床安全性和有效性的相關性等因素綜合考慮制定空殼率標準限度。應特別關注，如果空殼率檢測方法發(fā)生變更，應評估變更對檢測結果的影響，開展變更前后檢測方法的橋接對比研究，以合理擬定空殼率標準限度。

（五）效價檢測方法選擇的一般要求

效價是反映產(chǎn)品生物學活性的關鍵質量屬性。鼓勵早期臨床試驗階段，根據(jù)產(chǎn)品設計和對產(chǎn)品作用機制的理解，初步建立生物學活性分析方法，并對各批次進行檢測，例如，對目的基因表達產(chǎn)物的確認，目的基因的表達水平，表達產(chǎn)物的生物學活性等研究。隨著臨床試驗不斷推進，持續(xù)完善效價相關的關鍵質量屬性的確認和效價控制策略，并盡可能建立關鍵質量屬性與效價之間的相關性。產(chǎn)品上市申請階段，效價標準限度應基于生產(chǎn)經(jīng)驗以及產(chǎn)品開發(fā)和臨床研究批次積累的數(shù)據(jù)進行設定，綜合考慮關鍵臨床試驗批次數(shù)據(jù)、方法變異度以及穩(wěn)定性期間的變化情況進行修訂和完善。 

通常情況下，不同 rAAV 產(chǎn)品的作用機制可能不同，一些產(chǎn)品可能含有多種活性成分和/多種生物學活性，某些產(chǎn)品可能需要測定多種活性成分的濃度和效價。因此，不同產(chǎn)品效價檢測方法應結合具體情況具體分析。采用生物學測定方法作為效價檢測方法可能受多種因素影響，比如不同儀器之間差異影響，不同分析人員差異影響，以及生物學測定方法中使用的檢定用細胞、生物試劑等差異影響。因此，建議盡可能識別可能影響效價檢測方法的潛在影響因素，并充分評估這些因素對方法準確度、精密度等影響。同時，為進一步降低上述因素變異性對效價測定結果的影響，可考慮建立對照品/標準品，或者對每個待測樣品進行多次獨立分析運行并報告平均值。如果產(chǎn)品在研發(fā)期間發(fā)生變更，應結合變更內容、變更程度及變更風險提供充分的風險評估和研究數(shù)據(jù)，以證明該變更不會對產(chǎn)品的效價產(chǎn)生不利影響。

（六）可復制型腺相關病毒（Replication-competent AAV,rcAAV）檢測方法和標準限度制定的一般要求

1.rcAAV 檢測方法選擇的一般要求

rAAV 產(chǎn)品生產(chǎn)過程中，由于載體基因組、Rep/Cap 基因以及 ITR 序列可能發(fā)生同源和/或非同源重組，可能會形成具有復制能力和潛在感染性的野生型病毒，即 rcAAV。研究顯示，rcAAV 在輔助病毒（例如腺病毒 Ad5）存在條件下可以復制擴增，可能影響產(chǎn)品的安全性，是一種具有潛在風險的工藝相關雜質。因此，建議將 rcAAV 檢測納入產(chǎn)品質量標準。為了提高檢測方法靈敏度，建議采用細胞培養(yǎng)法與 PCR 相結合的方法。

2.rcAAV 檢測方法中陽性對照病毒的一般要求原則上，陽性對照病毒的血清型建議與產(chǎn)品一致。陽性對照病毒可以通過商業(yè)化購買，也可以自行構建，但無論通過何種途徑獲得，均應提供陽性對照病毒的來源、制備工藝、主要功能元件及感染滴度標定等研究資料，并關注陽性病毒在貯存期間感染滴度的穩(wěn)定性。

3.rcAAV 檢測方法中共培養(yǎng)細胞選擇的一般要求

考慮到不同血清型病毒對不同細胞的感染特性或感染能力不同，鼓勵盡可能基于產(chǎn)品特性篩選易感的細胞系，其可以通過商業(yè)化購買，也可以自行構建，但無論通過何種途徑獲得，均應提供檢定用細胞來源、細胞庫建庫和檢定等研究資料，關注細胞的傳代方式、培養(yǎng)條件等對方法檢測靈敏度的影響。

4.rcAAV 標準限度制定的一般要求？

rcAAV 標準限度應在上市階段結合方法驗證結果、批次數(shù)據(jù)積累、臨床安全性和有效性等情況合理設定。

（七）殘留宿主 DNA 片段大小質量控制的一般要求

1.rAAV 產(chǎn)品中殘留宿主 DNA 大小分布是否需要納入質量標準殘留宿主 DNA 具有潛在的致癌性、感染性及免疫原性，較長片段的宿主 DNA 風險相對較高，因此，建議在臨床試驗階段對宿主 DNA 片段大小進行持續(xù)監(jiān)測，積累多個批次數(shù)據(jù)，并關注宿主 DNA 片段大小分布變化情況。同時，根據(jù)臨床期間積累數(shù)據(jù)情況開展充分的安全性評估，基于積累的數(shù)據(jù)和安全性評估情況綜合評估是否納入質量標準。

2.殘留宿主 DNA 片段大小控制的一般要求

按照《體內基因治療產(chǎn)品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》的要求，如有可能，建議盡量將殘留 DNA 控制在10ng/劑以內，DNA 殘留片段的大小控制在 200bp 以下。鑒于目前部分 rAAV 產(chǎn)品可能難以達到殘留宿主 DNA 大小＜200bp的要求，建議結合具體品種類型，以及現(xiàn)有工藝對殘留宿主DNA 片段的去除能力等具體分析，通過開展更加充分的研究和安全性評估數(shù)據(jù)，證明殘留宿主 DNA 片段大小內控標準限度擬定的合理性。同時，基于提高產(chǎn)品質量和控制產(chǎn)品安全性，降低潛在安全性風險工藝相關雜質水平的考慮，鼓勵申請人通過不斷優(yōu)化生產(chǎn)工藝，盡可能降低>200bp 殘留宿主DNA 片段的比例。

三、參考文獻

1.ICH Q5A(R2). Viral safety evaluation ofbiotechnology products derived from cell lines ofhuman or animal origin.2023.

2.NMPA.體內基因治療產(chǎn)品藥學研究與評價技術指導原則.2022.

3.NMPA.重組腺相關病毒載體類體內基因治療產(chǎn)品臨床試驗申請藥學研究與評價技術指導原則.2023.

4.NMPA.溶瘤病毒產(chǎn)品藥學研究與評價技術指導原則（試行）.2023.

5.國家藥典委員會.《中華人民共和國藥典》(2025 年版).2025.

6.FDA.Potency tests for cellular and gene therapy products.2011.

7.FDA.Potency assurance for cellular and gene therapyproducts (draft guidance for industry).2023.

來源：CDE

原文下載：重組腺相關病毒載體類體內基因治療產(chǎn)品申報上市藥學共性問題與技術要求.pdf