藥包材細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法系將供試品或供試品溶液接觸細(xì)胞，通過(guò)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、增殖和抑制影響的觀察，評(píng)價(jià)供試品對(duì)體外細(xì)胞的毒性作用。

試驗(yàn)用細(xì)胞 推薦使用小鼠成纖維細(xì)胞 L-929。試驗(yàn)時(shí)采用傳代 48～72 小時(shí)生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞。

試驗(yàn)前的準(zhǔn)備 與樣品及細(xì)胞接觸的所有器具均需無(wú)菌。必要時(shí)可采用濕熱滅菌，如 115℃保持 30 分鐘；干熱滅菌，如 250℃保持 30 分鐘或用 180℃保持2 小時(shí)。供試品溶液的制備 取供試品，按照“藥包材生物學(xué)評(píng)價(jià)與試驗(yàn)選擇指導(dǎo)原則（9651）”中生物學(xué)試驗(yàn)的要求制備供試品溶液。

第一法 相對(duì)增殖度法

陰性對(duì)照液制備 為不加供試品的細(xì)胞培養(yǎng)液。

陽(yáng)性對(duì)照液制備 取陽(yáng)性參比物，按照供試品溶液的制備項(xiàng)下的規(guī)定進(jìn)行，也可使用 6.3%苯酚的細(xì)胞培養(yǎng)液。

試驗(yàn)方法 取 33 個(gè)培養(yǎng)瓶，分別加入 4×10 16 4個(gè)/mL 濃度的細(xì)胞懸液 1mL，細(xì)胞培養(yǎng)液 4mL，在 37℃±1℃，5%±1%CO2的條件下培養(yǎng) 24 小時(shí)。培養(yǎng) 24 小時(shí)后棄去原培養(yǎng)液。

陰性對(duì)照組： 取 13 個(gè)培養(yǎng)瓶分別加入 5mL 陰性對(duì)照液；

陽(yáng)性對(duì)照組： 取 10 個(gè)培養(yǎng)瓶分別加入 5mL 陽(yáng)性對(duì)照液。

供試品組： 取 10 個(gè)培養(yǎng)瓶分別加入 5mL 含 50%供試品溶液的細(xì)胞培養(yǎng)液，在 37℃±1℃，5%±1% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng) 7 天。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和計(jì)數(shù)：在更換細(xì)胞培養(yǎng)液的當(dāng)天，取 3 瓶陰性對(duì)照組，并在更換后第 7 天，每組各取 3 瓶進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)。

毒性評(píng)定 細(xì)胞形態(tài)分析標(biāo)準(zhǔn)按表 1 規(guī)定進(jìn)行。

     細(xì)胞相對(duì)增殖度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按表 2 規(guī)定進(jìn)行。

結(jié)果評(píng)價(jià) 供試品組相對(duì)增殖度（以第 7 天的細(xì)胞濃度計(jì)算）為 0 級(jí)或 1級(jí)判為合格。試驗(yàn)組相對(duì)增殖度為 2 級(jí)，應(yīng)結(jié)合形態(tài)綜合評(píng)價(jià)，輕微毒或無(wú)毒的判為合格。試驗(yàn)組相對(duì)增殖度為 3～5 級(jí)判為不合格。

第二法 瓊脂擴(kuò)散法

本法適用于彈性體細(xì)胞毒性的測(cè)定。當(dāng)聚合物供試品中可濾取的化學(xué)物質(zhì)擴(kuò)散時(shí)，瓊脂層可起到隔墊的作用保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。供試品溶液將通過(guò)一張濾紙（表面積不小于 100mm 37 2）進(jìn)行試驗(yàn)。

陰性對(duì)照制備 取陰性參比物，例如高密度聚乙烯，按照供試品溶液的制備項(xiàng)下的規(guī)定進(jìn)行。

陽(yáng)性對(duì)照制備 取陽(yáng)性參比物，例如二乙基二硫代氨基甲酸鋅的聚氨酯（ZDEC），按照供試品溶液的制備項(xiàng)下的規(guī)定進(jìn)行?？刹捎?10%二甲基亞砜（DMSO）溶液，附著到生物惰性吸收性（例如超細(xì)硼硅玻璃纖維濾紙）的基質(zhì)上。

試驗(yàn)方法 取細(xì)胞懸浮液（1×10 44 5個(gè)/mL）7mL，均勻分散至直徑 60mm 的培養(yǎng)皿中。置于 37℃±1℃，含 5%±1% CO2氣體的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 小時(shí)至近匯合單層細(xì)胞，棄去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，將溶化瓊脂冷卻至 48℃左右與含 20%血清的2倍新鮮哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基混合，使瓊脂最終質(zhì)量濃度不大于 2%，在每只培養(yǎng)皿內(nèi)加入新制備的含瓊脂培養(yǎng)基（要足夠薄以利于可瀝濾物的擴(kuò)散）。

含瓊脂培養(yǎng)基凝固后，可用適當(dāng)?shù)娜旧椒ㄈ旧?。將供試品、陰性?duì)照、陽(yáng)性對(duì)照小心地放在培養(yǎng)皿的固化瓊脂層表面。

每個(gè)供試品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照試樣間盡量保持合適的距離并遠(yuǎn)離培養(yǎng)皿壁，每一培養(yǎng)皿中放置不超過(guò) 3 個(gè)試樣，每個(gè)試樣至少設(shè)置 2 個(gè)平行。置37℃±1℃，5%±1%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中至少培養(yǎng) 24 小時(shí)±2 小時(shí)。用顯微鏡觀察每個(gè)供試品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照試樣反應(yīng)區(qū)域。用活體染料，如中性紅有助于檢測(cè)細(xì)胞毒性。

結(jié)果評(píng)價(jià) 按表 3 進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)和分級(jí)。如陰性對(duì)照為 0 級(jí)（無(wú)毒）、

      陽(yáng)性對(duì)照不小于 3 級(jí)（中度毒），則細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)系統(tǒng)有效。

供試品和/或供試品溶液細(xì)胞毒性分級(jí)不大于 2 級(jí)（輕度毒）時(shí)，則判為合格。

第三法 直接接觸法

供試品制備 采用供試品的平整部分，表面積不小于 100mm 62 2。

陰性對(duì)照制備 取陰性參比物，例如高密度聚乙烯，按與供試品相同方式制備。

陽(yáng)性對(duì)照制備 取陽(yáng)性參比物，與供試品相同方式制備。

試驗(yàn)方法 取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞懸浮液（1×10 66 5個(gè)/mL）2mL，置直徑 35mm 的

平皿中培養(yǎng)單層細(xì)胞。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 小時(shí)至近匯合單層細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，替換為 0.8mL 的新鮮培養(yǎng)基。

在每個(gè)培養(yǎng)皿中單獨(dú)放置 1 個(gè)供試品、陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照，每個(gè)試樣至少設(shè)置 2 個(gè)平行。將所有的培養(yǎng)物置 37℃±1℃含 5%±1%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中至少培養(yǎng) 24 小時(shí)，培養(yǎng)箱宜保持適當(dāng)?shù)臐穸取ｏ@微鏡下觀察每個(gè)供試品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照周?chē)?，必要時(shí)應(yīng)進(jìn)行染色。

結(jié)果評(píng)價(jià) 按照瓊脂擴(kuò)散法結(jié)果評(píng)價(jià)項(xiàng)下的規(guī)定進(jìn)行。若樣品不超過(guò) 2 級(jí)（輕度毒），則樣品判為合格。若試驗(yàn)系統(tǒng)無(wú)效需重復(fù)試驗(yàn)過(guò)程。

 第四法 浸提法

陰性對(duì)照制備 取陰性參比物，例如高密度聚乙烯，按照供試品溶液的制備項(xiàng)下的規(guī)定進(jìn)行。

陽(yáng)性對(duì)照制備 取陽(yáng)性參比物，按照供試品溶液的制備項(xiàng)下的規(guī)定進(jìn)行

試驗(yàn)方法 取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞懸浮液（1×10 79 5 個(gè)/mL）2mL，置直徑 35mm的平皿中培養(yǎng)單層細(xì)胞。培養(yǎng)不少于 24 小時(shí)至細(xì)胞至少達(dá)到 80%近匯合后，吸去培養(yǎng)基，替換為供試品溶液、陰性對(duì)照液或陽(yáng)性對(duì)照液。含血清培養(yǎng)基提取液和不含血清培養(yǎng)基提取液無(wú)需稀釋?zhuān)叫性囼?yàn) 2 份。0.9%氯化鈉注射液為介質(zhì)的提取液用含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至提取液濃度為 25%，平行試驗(yàn) 2 份。所有的培養(yǎng)物在 37℃±1℃，含 5%±1%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 小時(shí)。48 小時(shí)后，在顯微鏡下觀察培養(yǎng)物，如有必要，進(jìn)行染色。

結(jié)果評(píng)價(jià) 按表 4 進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)和分級(jí)。若試驗(yàn)系統(tǒng)不成立，重復(fù)試驗(yàn)。供試品不超過(guò) 2 級(jí)（輕度毒），則判為合格。如需進(jìn)行劑量-反應(yīng)程度評(píng)價(jià)，可通過(guò)定量稀釋樣品提取液，重復(fù)試驗(yàn)。

來(lái)源：藥典委會(huì)員會(huì)

附4-藥包材細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法 .pdf