附件1

幽門螺桿菌耐藥基因突變檢測試劑

注冊審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對幽門螺桿菌耐藥基因檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門提供參考。

本指導(dǎo)原則是對幽門螺桿菌耐藥基因檢測試劑的一般要求，注冊申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本指導(dǎo)原則是供注冊申請人和技術(shù)審評人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究和驗證資料。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認知水平下制定，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于采用實時熒光PCR法等分子生物學(xué)技術(shù)，對來自于人體的胃黏膜組織、糞便等樣本中的幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）耐藥基因進行體外定性檢測的試劑，臨床主要用于幽門螺桿菌耐藥的輔助診斷。

申報產(chǎn)品的適用人群應(yīng)為幽門螺桿菌感染的確診患者。幽門螺桿菌感染的確診可以為尿素呼氣試驗（UBT）、已上市幽門螺桿菌核酸或抗原檢測試劑、組織學(xué)檢測等。

幽門螺桿菌不同基因與表型的耐藥性之間符合率有較大差異，建議申請人選擇公認符合率較高的抗生素耐藥基因作為靶標(biāo)，如克拉霉素耐藥基因、左氧氟沙星耐藥基因等。針對同一抗生素存在多個耐藥基因或耐藥突變位點的，申請人應(yīng)考慮申報產(chǎn)品對耐藥基因/位點的覆蓋率。如針對同一抗生素的不同耐藥基因位點的陽性結(jié)果對用藥判斷一致，申報產(chǎn)品可設(shè)計為不同基因單獨檢測，結(jié)果報告為具體突變類型；也可設(shè)計為不區(qū)分具體突變類型，結(jié)果報告為耐藥/敏感。建議在產(chǎn)品預(yù)期用途中明確，如：本產(chǎn)品用于體外定性檢測來自幽門螺桿菌感染的確診患者的xx樣本中的yy耐藥基因突變，可檢測的突變類型包括xx基因zz突變，本產(chǎn)品可/不區(qū)分具體突變類型。針對耐藥基因的表述，應(yīng)滿足臨床通用的要求，如針對23S rRNA基因的A2142G、A2143G和A2142C點突變，針對gyrA 基因的A260T、C261A、T261G、G271A、G271T、A272G點突變等。 

幽門螺桿菌耐藥基因檢測的產(chǎn)品不用于幽門螺桿菌感染的輔助診斷，此類產(chǎn)品不用于判斷樣本中幽門螺桿菌核酸的陰性或陽性。但在產(chǎn)品設(shè)計中，建議針對幽門螺桿菌保守核酸序列進行檢測，檢測結(jié)果作為幽門螺桿菌耐藥基因檢測的質(zhì)控，只有當(dāng)該質(zhì)控陽性時才能進行后續(xù)耐藥基因突變檢測結(jié)果的判定。

對于采用其他方法學(xué)或者其他樣本類型的幽門螺桿菌耐藥基因檢測試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，注冊申請人應(yīng)參照本指導(dǎo)原則，根據(jù)產(chǎn)品特性對適用部分進行評價，并補充其他的評價。

本指導(dǎo)原則適用于幽門螺桿菌耐藥基因檢測試劑進行產(chǎn)品注冊和變更注冊的情形。本指導(dǎo)原則針對注冊申報資料中的部分內(nèi)容進行撰寫，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等相關(guān)法規(guī)要求，同時建議參考《定性檢測試劑分析性能評估注冊審查指導(dǎo)原則》等適用的技術(shù)文件要求。

二、注冊審查要點

（一）監(jiān)管信息

1.產(chǎn)品名稱及分類編碼

    產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求，如幽門螺桿菌gyr A基因突變檢測試劑盒（PCR熒光探針法）。按照《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2.注冊申請人還需提交產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報前與監(jiān)管機構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。其中，需注意以下內(nèi)容：

1. 明確檢測位點的臨床意義，尤其是對于新突變位點，應(yīng)提交支持檢測位點臨床意義的行業(yè)認可證據(jù)（如國內(nèi)相關(guān)指南或?qū)＜夜沧R）及支持性文獻等，詳述位點導(dǎo)致耐藥機制、氨基酸突變位點（如適用）、基因型與表型耐藥符合率，以及抗生素用藥背景以及中國人群數(shù)據(jù)等。

2. 檢驗原理中詳細說明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測流程，明確產(chǎn)品檢測靶基因及靶序列，需選擇保守性和特異性相對較高的基因和靶序列，同時還應(yīng)考慮擴增效率。提供引物和探針的設(shè)計依據(jù)。提供核酸提?。ㄊ止ず妥詣犹崛》绞綉?yīng)分別明確）及檢測所用時間，提供不同適用機型的檢測通量（如適用）。

3. 預(yù)期用途需明確可檢測靶基因、對應(yīng)氨基酸突變（如有）及藥物、樣本類型、采樣部位、適用人群等。

4. 與已上市同類和/或前代產(chǎn)品進行比較，比較內(nèi)容包括方法學(xué)、檢驗原理、樣本類型、采樣部位及采樣方式、檢測靶基因、組成成分、內(nèi)標(biāo)、質(zhì)控品、判讀規(guī)則、預(yù)期用途、適用人群、分析性能和臨床性能等方面。

（三）非臨床資料

1.產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告

    按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求編寫產(chǎn)品技術(shù)要求，性能指標(biāo)一般包括陽性參考品符合率、陰性參考品符合率、最低檢出限、精密度等，并提交三個不同批次符合產(chǎn)品技術(shù)要求的全項目檢驗報告。提交資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊申報資料要求及說明》《醫(yī)療器械注冊自檢管理規(guī)定》等相關(guān)文件的要求。

2.分析性能研究

注冊申請人應(yīng)當(dāng)在原材料和生產(chǎn)工藝經(jīng)過選擇和確認、質(zhì)量管理體系得到有效控制并且保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，采用完整、確定的檢測系統(tǒng)進行分析性能評估。

對于每項分析性能的評價都應(yīng)包括具體研究目的、研究方法、試驗方案、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細資料。有關(guān)分析性能驗證的背景信息也需在申報資料中有所體現(xiàn)，包括試驗地點、采用的試劑名稱、規(guī)格和批號，儀器名稱和型號，樣本類型和來源等。

分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、樣本采集和處理方式、稀釋方式等。研究中采用的幽門螺桿菌耐藥基因突變陽性樣本，應(yīng)采用科學(xué)合理的方法確定其突變類型、突變比例/濃度水平，并提交具體的試驗資料。分析性能評估用樣本一般應(yīng)為真實樣本（臨床樣本或培養(yǎng)菌株添加至陰性臨床樣本基質(zhì)），不建議采用質(zhì)粒等進行分析性能評估，如涉及稀釋后檢測，應(yīng)采用與適用樣本類型一致的陰性基質(zhì)進行稀釋。對于各項性能中采用的樣本，在下述各項性能研究資料中分別提供樣本信息列表。檢出限和包容性研究中所用樣本應(yīng)相互獨立。

針對適用的不同樣本類型分別進行分析性能研究。

如申報產(chǎn)品用于不同適用機型，應(yīng)采用一個或多個機型，進行充分的試劑分析性能建立研究，對于其他機型，應(yīng)分析各適用機型的工作原理、檢測方法、反應(yīng)條件控制、信號處理等，如基本相同，可基于風(fēng)險分析對已建立的分析性能指標(biāo)進行合理驗證。所有適用機型驗證的分析性能應(yīng)基本一致，如不同機型對某一檢測項目的某一分析性能存在差異，應(yīng)針對該差異采用不同機型進行充分的分析性能建立研究。

如試劑包含不同的包裝規(guī)格，且不同規(guī)格間存在性能差異，需采用每個包裝規(guī)格產(chǎn)品進行分析性能評估；如不同規(guī)格間不存在性能差異，需要詳細說明各規(guī)格間的差別及可能產(chǎn)生的影響，采用具有代表性的包裝規(guī)格進行分析性能評估。

建議著重對以下分析性能進行研究。

2.1樣本穩(wěn)定性

對樣本穩(wěn)定性進行詳細研究，包括采集后未經(jīng)處理的樣本，不同的樣本采集處理方法，加入不同裂解液/消化液/保存液的樣本（如適用），研究內(nèi)容包括冷藏保存時間，冷凍保存時間，凍融次數(shù)等。

如產(chǎn)品適用不同的樣本類型，應(yīng)對每種樣本類型進行穩(wěn)定性研究。

如核酸提取液可不立即進行檢測，還需對核酸提取液的保存條件和保存時間進行研究。

2.2準(zhǔn)確度

2.2.1建議采用申報試劑與已明確型別和濃度樣本或與已上市產(chǎn)品或其他對比方法同時檢測臨床樣本比較耐藥基因與內(nèi)控基因檢測結(jié)果之間的一致性程度。研究應(yīng)納入一定數(shù)量的陰性和陽性樣本，并注意覆蓋每種突變類型。

2.2.2企業(yè)參考品驗證

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用至少三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進行檢驗并提供詳細的試驗數(shù)據(jù)。

2.3精密度

精密度評價應(yīng)對可能影響檢測精密度的主要因素進行驗證，除檢測試劑（包括核酸提取/純化組分）本身外，還包括儀器、操作者、時間、地點、檢測輪次、試劑批次等，設(shè)計合理的精密度評價周期，并對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間、不同操作者間和不同實驗室間的精密度進行綜合評價。

針對所有待測突變位點進行精密度驗證，并采用真實樣本進行研究，同時至少采用3個濃度水平：

陰性樣本：待測物濃度低于最低檢測限，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。

檢出限水平樣本：待測物濃度為檢出限濃度，陽性檢出率應(yīng)大于95%（n≥20）。

中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%，且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

2.5檢出限

  檢出限研究應(yīng)針對所有待測突變位點進行評價。使用已明確突變位點和濃度的培養(yǎng)菌株，采用與適用樣本類型一致的陰性基質(zhì)進行系列稀釋，進行最低檢測限的建立和驗證。建議采用數(shù)字PCR、標(biāo)準(zhǔn)曲線（通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或構(gòu)建質(zhì)粒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）等方法進行菌株核酸濃度/突變位點濃度的確認，以copies/mL作為表示方式。明確每份菌株的來源、濃度、制備方法等信息。

2.5.1檢出限的建立

對于此類產(chǎn)品，擴增反應(yīng)終體系中的耐藥突變序列所占百分率和總核酸濃度兩個因素對最低檢測限的影響較大，終體系中耐藥突變序列所占百分率越高、所含的總DNA量越多，則越容易檢出。因此，試劑盒最低檢測限評價主要考慮以下兩個方面。

100%耐藥比例下，耐藥菌株的最低檢測濃度

將幽門螺桿菌耐藥菌株用陰性基質(zhì)進行系列稀釋，制備不同濃度的耐藥菌株樣本。分別對各濃度樣本進行不少于20次的重復(fù)檢測，確定95%陽性檢出率水平，作為可檢測的最低耐藥菌株濃度。

不同菌株濃度、各種耐藥比例的最低檢測限

將不同濃度野生菌株和耐藥菌株進行混合，調(diào)整野生和耐藥菌株的比例，得到含不同菌株濃度和各種耐藥比例的菌株混合液。對各份混合液進行不少于20次的重復(fù)檢測，確定95%陽性檢出率水平下的濃度水平，即在固定的核酸濃度條件下，可以檢測到的最低的突變序列百分率。

2.5.2檢出限的驗證

針對每種突變類型選擇不同于建立用臨床樣本，在已建立的檢出限水平進行至少20次的重復(fù)檢測，應(yīng)滿足95%以上檢出率要求。

2.6包容性

根據(jù)試劑盒檢測范圍選擇具有時間和區(qū)域特征性的不同來源的臨床樣本或培養(yǎng)菌株。每種突變位點不少于5例樣本，研究應(yīng)包括檢出限和重復(fù)性的驗證。

2.7分析特異性

2.7.1交叉反應(yīng)

2.7.1.1常見病原體交叉反應(yīng)

交叉反應(yīng)驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面：近緣菌、易引起相同或相似的臨床癥狀微生物、感染部位附近的定植菌等。糞便樣本建議考慮空腸彎曲菌、梭狀芽胞桿菌屬 、埃希菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬、變形桿菌屬、人感染其他螺桿菌 （如：海爾曼螺桿菌、鼠螺桿菌、豬螺桿菌等）；胃黏膜組織建議考慮空腸彎曲菌、變形桿菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸菌屬、人感染其他螺桿菌 （如：海爾曼螺桿菌、鼠螺桿菌、豬螺桿菌等）。

建議在病毒和細菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進行交叉反應(yīng)的驗證。通常，細菌感染的水平為10⁶ CFU/mL或更高，病毒為10⁵ PFU/mL或更高。

申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的微生物的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。

2.7.1.2申報產(chǎn)品包含的不同耐藥突變位點之間的交叉反應(yīng)、申報產(chǎn)不包含的其它幽門螺桿菌耐藥基因突變的交叉反應(yīng)。

2.7.1.3其他耐藥細菌交叉：建議納入具有申報產(chǎn)品耐藥表型的其他細菌的交叉研究，如耐左氧氟沙星金黃色葡萄球菌等。

在交叉反應(yīng)研究中，申請人除關(guān)注對耐藥基因檢測結(jié)果的影響，還應(yīng)關(guān)注內(nèi)控基因的檢出變化。

2.7.2干擾研究

根據(jù)所采集樣本類型，針對可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進行驗證。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行試驗，檢測至少包含臨界陽性水平在內(nèi)的幽門螺桿菌樣本。對結(jié)果進行合理的統(tǒng)計分析，對比添加干擾物質(zhì)前后的 Ct 值差異。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)及在樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)。

2.7.2.1內(nèi)源性干擾

糞便樣本：白細胞、血紅蛋白、脂肪、腸道分泌物或粘液 、膳食纖維、多糖等。

胃黏膜組織：血液、粘蛋白、白細胞、膽汁、胃液、胃蛋白酶等。

2.7.2.2外源性干擾

抗菌藥物：克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、四環(huán)素、甲硝唑、呋喃唑酮等。

其他常見治療藥物：質(zhì)子泵抑制（如奧美拉唑、艾司奧美拉唑、雷貝拉唑、蘭索拉唑、泮托拉唑、艾普拉唑等）、鉍劑（如枸櫞酸鉍、膠體果膠鉍、次水楊酸鉍等）、鉀離子競爭性酸阻滯劑（如伏諾拉升、替戈拉生、凱普拉生等）、痔瘡膏、通便靈、鋁碳酸鎂、乳酸菌素和中成藥、促胃腸動力藥（多潘立酮、莫沙必利等）、消化酶等。

益生菌：乳桿菌、雙歧桿菌、丁酸梭菌、枯草二聯(lián)桿菌，地衣芽孢桿菌等。

胃黏膜組織樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)（如去泡劑：二甲硅油、西甲硅油等）。

2.7.2.3競爭性干擾

臨床上存在多種耐藥基因突變的情況，應(yīng)考慮評價高濃度分析物對低濃度分析物檢測的影響。競爭性感染的突變位點組合建議考慮同一反應(yīng)體系內(nèi)常見不同耐藥突變位點混合存在的情形，考察高濃度/高突變比例位點對低濃度/低突變位點檢測的影響。

2.8核酸提取/純化性能

核酸提取/純化步驟的目的除最大量分離出目標(biāo)DNA外，還有相應(yīng)的純化作用，應(yīng)盡可能去除PCR抑制物。糞便樣本類型對PCR抑制物的去除要求較高，在核酸提取試劑的選擇中應(yīng)關(guān)注。

研究確定核酸提取方法，闡述核酸提取原理，提交提取方案選擇研究資料。無論申報產(chǎn)品是否含有DNA分離/純化的組分，注冊申請人都應(yīng)對配合使用的所有核酸提取試劑進行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進行抗干擾、再現(xiàn)性和檢出限的驗證。如果配套核酸提取試劑提取原理存在差異，還需額外進行檢出限的建立研究。

2.10反應(yīng)體系

2.10.1樣本采集和處理

2.10.1.1詳述樣本采集部位、采集方式、樣本采集量的選擇，提供相關(guān)的研究資料。包括對樣本的收集、制備或處理、運輸（如涉及）和儲存的方式進行驗證，必要時進行選擇和確認并提供相關(guān)的研究資料。不同類型的樣本應(yīng)分別進行研究。參考布里斯托（Bristol）大便分類法，糞便樣本建議關(guān)注對不同類型糞便的研究，如有不適合樣本（如水樣便）應(yīng)在說明書明確。胃黏膜組織樣本建議關(guān)注采樣位點位置（如幽門胃竇/胃體）、數(shù)量等。

2.10.1.2樣本采集時間點的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況、用藥間隔等因素的影響。

2.10.1.3樣本處理方式的選擇：研究樣本適用的保存和處理方式，包括樣本用量、糞便沉淀/離心處理、組織研磨、蛋白酶消解等。

2.10.2核酸提取和反應(yīng)體系

研究確定最佳核酸提取和反應(yīng)體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積、PCR反應(yīng)加樣體積及反應(yīng)各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。

提交不同適用機型基線和閾值循環(huán)數(shù)的確定資料。

不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗證資料。

3.穩(wěn)定性研究資料

申報試劑的穩(wěn)定性主要包括實時穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、使用穩(wěn)定性等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。對于開瓶穩(wěn)定性研究應(yīng)模擬真實使用情形，包括開瓶穩(wěn)定性的開瓶頻次和開瓶時間等。

4.陽性判斷值研究資料

陽性判斷值研究樣本來源應(yīng)為預(yù)期人群，并考慮不同性別、年齡、地域等因素，盡可能考慮樣本來源的多樣性、代表性，盡量納入較多弱陽性的樣本，以及一定數(shù)量的其他容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的樣本。申報產(chǎn)品如區(qū)分突變類型，應(yīng)對不同突變位點應(yīng)分別進行統(tǒng)計分析。建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式確定申報試劑陽性判斷值，亦可采用其他科學(xué)合理的方法進行研究。如判定值存在灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認資料。如產(chǎn)品設(shè)計了內(nèi)控基因用于質(zhì)控幽門螺桿菌感染，也應(yīng)提交內(nèi)控基因陽性判斷值研究。

提交陽性判斷值建立及驗證研究資料時，應(yīng)包括研究方案、設(shè)定評價標(biāo)準(zhǔn)、研究過程以及研究原始數(shù)據(jù)等。其中所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、樣本類型、臨床診斷信息、樣本來源機構(gòu)、檢測結(jié)果等信息。

如果產(chǎn)品適用不同樣本類型，應(yīng)對各樣本類型進行陽性判斷值的驗證。

提供內(nèi)標(biāo)檢測結(jié)果范圍的確定方法和研究資料。

5.其他資料

5.1主要原材料研究資料

此類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、企業(yè)參考品、質(zhì)控品等。應(yīng)提供主要原材料的來源與選擇、制備過程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細的制備、鑒定和質(zhì)量控制過程，制備工藝應(yīng)相對穩(wěn)定；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗資料、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的入廠檢驗報告。生產(chǎn)商應(yīng)固定，不得隨意更換。

5.1.1引物和探針

應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計原則，包括對包容性和特異性的考慮情況，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點及兩者的對應(yīng)情況。產(chǎn)品的內(nèi)控基因的引物探針建議針對幽門螺桿菌保守核酸序列設(shè)計。建議設(shè)計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和功能性試驗等方式，對產(chǎn)品檢出限、包容性和特異性進行評價。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度、探針標(biāo)記的熒光素及功能性試驗等。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTPs）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP，應(yīng)提交對其純度、濃度、功能性試驗等的驗證資料，并確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

5.1.4酶

需要的酶主要包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶（如有）等，應(yīng)分別對酶活性、熱穩(wěn)定性、功能性等進行評價和驗證。

5.1.4質(zhì)控品

試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。陽性質(zhì)控品應(yīng)包含試劑盒檢測的靶序列，可采用質(zhì)粒等制備。如產(chǎn)品設(shè)置應(yīng)用于陽性判斷值判斷的野生型陽性質(zhì)控品，應(yīng)考慮靶標(biāo)序列的完整性。質(zhì)控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程，以對整個提取和PCR擴增過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進行合理質(zhì)量控制。提交試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗資料，對質(zhì)控品的檢測結(jié)果Ct值范圍做出明確的要求。

5.1.5內(nèi)標(biāo)

內(nèi)標(biāo)，又稱內(nèi)對照，可對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴增。申請人需對內(nèi)標(biāo)的引物、探針設(shè)計和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果Ct值范圍。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)標(biāo)，對待測樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進行監(jiān)控。

5.1.6企業(yè)參考品

該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和精密度參考品。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際需要設(shè)置企業(yè)參考品。 

應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、耐藥位點及突變比例、濃度確認方法或試劑等相關(guān)驗證資料。企業(yè)參考品應(yīng)采用臨床樣本，或者使用培養(yǎng)菌株加入陰性基質(zhì)。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：

陽性參考品：應(yīng)設(shè)置不同的濃度水平，并應(yīng)包括申報產(chǎn)品聲稱可檢測的突變位點。

陰性參考品：主要涉及對交叉反應(yīng)的驗證情況，納入陰性臨床樣本、野生型幽門螺桿菌、空腸彎曲菌、檢測范圍外的其他耐藥突變位點。

檢出限參考品：可采用95%陽性檢出水平或略高于檢出限的水平（應(yīng)明確幽門螺桿菌核酸濃度和耐藥突變比例）。包含所有的耐藥突變位點，可采用待測幽門螺桿菌耐藥基因突變陽性培養(yǎng)菌株和野生幽門螺桿菌培養(yǎng)菌株進行適當(dāng)?shù)呐渲啤?/span>

精密度參考品：精密度參考品應(yīng)包含申報產(chǎn)品聲稱的主要耐藥突變位點，試劑盒包含不同反應(yīng)體系時，精密度參考品應(yīng)至少包含每個反應(yīng)體系的代表性位點。至少包括弱陽性（低濃度突變）水平。

5.2生產(chǎn)工藝研究資料

生產(chǎn)工藝研究資料主要包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTP濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標(biāo)記等工藝過程的描述及確定依據(jù)。生產(chǎn)過程應(yīng)對關(guān)鍵參數(shù)進行有效控制，可采用流程圖方式描述生產(chǎn)工藝，標(biāo)明關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細說明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

2.臨床試驗方法

2.1與對比方法的比較研究

2.1.1對于已有同類產(chǎn)品上市的，臨床試驗應(yīng)選擇已上市的同類產(chǎn)品作為對比試劑，評價申報產(chǎn)品與已上市同類產(chǎn)品的一致性，評價內(nèi)容應(yīng)包括耐藥基因及位點的檢測和相關(guān)內(nèi)控基因的檢測。對比試劑的選擇應(yīng)考慮檢測的耐藥基因及突變位點范圍、適用的樣本類型、產(chǎn)品性能等方面應(yīng)與試驗體外診斷試劑具有良好的可比性，選擇已上市同類產(chǎn)品進行臨床試驗時，對比試劑配套使用的核酸提取試劑應(yīng)滿足其說明書要求。

對比方法建議選擇能夠區(qū)分不同基因及不同突變位點的產(chǎn)品。如臨床試驗選擇不區(qū)分突變位點的產(chǎn)品作為對比產(chǎn)品，臨床試驗還應(yīng)針對對比方法檢測陽性病例采用合適的方法確認突變類型。

2.1.2對于尚無同類產(chǎn)品上市的，申請人可采用試驗體外診斷試劑與核酸序列測定（如Sanger測序等）方法進行對比試驗，評價兩種檢測方法的一致性，評價內(nèi)容應(yīng)包括耐藥基因及位點的檢測和相關(guān)內(nèi)控基因的檢測。

臨床試驗資料中應(yīng)對測序方法進行詳細的介紹，針對測序過程的引物設(shè)計應(yīng)提供依據(jù)。明確檢測過程中配套使用的核酸提取試劑，針對測序方法提交性能驗證數(shù)據(jù)，證明測序方法與試驗體外診斷試劑的可比性。如測序試驗委托其他機構(gòu)完成，還應(yīng)提交由臨床試驗機構(gòu)委托第三方機構(gòu)/實驗室開展相關(guān)試驗的測序服務(wù)合同/協(xié)議。

2.2與藥敏試驗的比較研究

在上述比較研究的基礎(chǔ)上，為了進一步評價產(chǎn)品臨床性能，臨床試驗還應(yīng)采用試驗用體外診斷試劑與幽門螺桿菌體外藥敏試驗（如E-test試驗等）進行比較研究。臨床試驗過程中選擇的微生物藥敏檢測試劑抗生素應(yīng)與產(chǎn)品說明書預(yù)期用途中明確的抗生素一致。

3.臨床試驗受試人群的選擇

臨床試驗的受試人群應(yīng)來自產(chǎn)品的預(yù)期適用人群，基于產(chǎn)品預(yù)期用途，臨床試驗入組人群應(yīng)為已確診為幽門螺桿菌感染的病例。幽門螺桿菌感染的確診可以為尿素呼氣試驗（UBT）、已上市幽門螺桿菌核酸或抗原檢測試劑、組織學(xué)檢測等。

針對2.1與對比方法的比較研究(耐藥基因檢測與已上市同類產(chǎn)品和/或核酸序列測定方法的比對研究)，因入組病例在治療前及治療后病原體載量及耐藥情況可能存在差異，為了充分評價產(chǎn)品性能，建議臨床試驗針對治療前和治療后的病例均有一定數(shù)量的入組。

針對該類產(chǎn)品特點，產(chǎn)品在設(shè)計過程中包括內(nèi)控基因。為了進一步評價內(nèi)控基因的性能，臨床試驗需開展內(nèi)控基因與已上市同類產(chǎn)品或核酸序列測定方法的比對，該部分研究入組人群應(yīng)為疑似幽門螺桿菌感染的病例。

臨床試驗應(yīng)針對耐藥基因入組一定數(shù)量的弱陽性病例。

4.臨床試驗樣本類型

幽門螺桿菌耐藥基因檢測可能涉及的樣本類型包括胃粘膜組織、糞便等。臨床樣本的采集建議按照國家衛(wèi)健委發(fā)布的相關(guān)實驗室檢測技術(shù)方案執(zhí)行。對于胃黏膜組織，如臨床前性能研究確認新鮮胃黏膜組織和凍存胃黏膜組織之間不存在差異，則臨床試驗可以匯總統(tǒng)計或以其中一種開展。

如申報產(chǎn)品適用于不同的樣本類型，例如胃粘膜組織、糞便等，應(yīng)針對不同樣本類型分別進行臨床性能評價，包括分別進行樣本量的估算等。

5.臨床試驗樣本量

建議采用單組目標(biāo)值法公式進行樣本量估算，臨床試驗陽性樣本和陰性樣本數(shù)量應(yīng)分別滿足統(tǒng)計學(xué)要求。

5.1針對與已上市同類產(chǎn)品或核酸序列測定方法的對比試驗，可采用單組目標(biāo)值法公式分別估算每個抗生素耐藥基因的最低陽性和陰性樣本例數(shù)。

樣本量估算公式如下，

公式中，n為樣本量；Z_1-α/2、Z_1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分數(shù)位，P₀為評價指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，P_T為申報產(chǎn)品評價指標(biāo)預(yù)期值。

其中陽性符合率和陰性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P₀）建議不低于90%。臨床試驗結(jié)果中，相關(guān)評價指標(biāo)的95%置信區(qū)間下限應(yīng)不低于預(yù)設(shè)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)評價指標(biāo)P接近100%時，上述樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進行樣本量估算和統(tǒng)計學(xué)分析，如精確概率法等。

臨床試驗中，針對產(chǎn)品檢測范圍內(nèi)的每種突變位點均應(yīng)具有一定的陽性例數(shù)。針對臨床常見的各突變位點分別不低于70例。針對臨床試驗過程中較難收集的突變位點，病例數(shù)不少于30例。

5.2針對與藥敏試驗的對比試驗，可采用單組目標(biāo)值法公式分別估算每個抗生素的最低耐藥和敏感樣本例數(shù)。其中靈敏度和特異度的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P₀）的設(shè)置應(yīng)滿足臨床使用需求。

5.3針對內(nèi)控基因與已上市同類產(chǎn)品或核酸序列測定方法的對比試驗，可采用單組目標(biāo)值法公式分別估算最低陽性和陰性樣本例數(shù)。其中陽性符合率和陰性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P₀）的設(shè)置應(yīng)滿足臨床使用需求。

6.臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析

臨床試驗結(jié)果一般以四格表的形式進行總結(jié)，并據(jù)此計算試驗體外診斷試劑的靈敏度和特異度，或與對比方法的陽性/陰性符合率及其95%置信區(qū)間。

臨床試驗報告中應(yīng)對入組受試者的基本情況進行分析，包括受試者年齡、性別的分布情況，以及臨床診斷背景、既往治療情況等。特別應(yīng)針對用于特異性評價的各類受試者進行歸類匯總，確認入組樣本具有較好的代表性。臨床試驗中如涉及不同樣本類型，應(yīng)針對每種樣本類型分別進行統(tǒng)計分析。

臨床試驗應(yīng)針對經(jīng)治療及未經(jīng)治療的病例進行亞組分析，產(chǎn)在兩個亞組中的性能應(yīng)滿足臨床要求。

臨床試驗中所有不一致結(jié)果均應(yīng)結(jié)合患者的臨床癥狀、臨床診斷以及疾病治療、轉(zhuǎn)歸等信息進行充分的分析。臨床試驗結(jié)果應(yīng)能夠證明產(chǎn)品臨床性能滿足臨床要求。

7.境外臨床試驗數(shù)據(jù)的認可

境外臨床試驗數(shù)據(jù)應(yīng)符合《接受醫(yī)療器械境外臨床試驗數(shù)據(jù)技術(shù)指導(dǎo)原則》和《使用體外診斷試劑境外臨床試驗數(shù)據(jù)的注冊審查指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。提交完整的臨床試驗方案、報告和倫理審查意見，以及該數(shù)據(jù)適用于中國患者人群的論證資料、境內(nèi)外臨床試驗質(zhì)量管理差異的對比資料和臨床試驗質(zhì)量管理差異對于臨床試驗結(jié)果影響的論證資料。

注冊申請人應(yīng)根據(jù)上述臨床試驗技術(shù)審評要求，論證境外臨床試驗數(shù)據(jù)的充分性。

8.臨床證據(jù)的形式要求

申請人應(yīng)按照《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》、《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等法規(guī)文件要求提交各機構(gòu)倫理審查意見、臨床試驗方案、臨床試驗小結(jié)、臨床試驗報告以及臨床試驗數(shù)據(jù)庫。

臨床試驗數(shù)據(jù)匯總表中應(yīng)提供病例的臨床診斷結(jié)果及支持病例臨床診斷結(jié)果的信息。

（五）產(chǎn)品說明書和標(biāo)簽樣稿

產(chǎn)品說明書格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求。產(chǎn)品說明書中技術(shù)內(nèi)容均應(yīng)與注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，應(yīng)以規(guī)范格式進行標(biāo)注，并單獨列明文獻的相關(guān)信息。

幽門螺桿菌耐藥基因突變檢測試劑說明書編寫應(yīng)重點關(guān)注以下內(nèi)容。

1.【預(yù)期用途】

1.1試劑盒用于體外定性檢測已確診為幽門螺桿菌感染的患者XX樣本中的yy耐藥基因突變，可檢測的突變類型包括xx基因zz突變，本產(chǎn)品可/不區(qū)分具體突變類型。

1.2 試劑盒用于XXX（抗生素）耐藥的臨床輔助診斷，為臨床醫(yī)生評估個體中幽門螺桿菌的耐藥性提供參考。

1.3適用人群：已確診為幽門螺桿菌感染的患者。

1.4簡要介紹幽門螺桿菌耐藥基因突變位點的特征，包括突變位點的描述，所檢測的耐藥突變位點與相應(yīng)藥物的相關(guān)性。

1.5強調(diào)該試劑盒檢測結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為治療藥物調(diào)整的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情及其他實驗室檢測指標(biāo)等因素對患者治療進行綜合判斷。

2.【檢驗原理】

簡述核酸提取純化及試劑盒檢測原理，說明檢測的耐藥突變位點信息，明確內(nèi)標(biāo)基因名稱及其作用。如采用了防污染措施，進行簡要描述。如可進行幽門螺桿菌陰陽性判定，應(yīng)對其原理簡要描述。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分及具體成分，明確需要但未提供的材料，如核酸提取試劑、樣本保存液及其他配套使用的材料的產(chǎn)品名稱、生產(chǎn)廠家、貨號及注冊證號或備案號等信息。

4.【樣本要求】

明確樣本采集時間點的選擇，是否受臨床癥狀、用藥情況、用藥間隔等因素的影響等。

詳細描述樣本采集、保存、運輸和處理方式，包括采樣步驟，采樣量，保存液使用體積等。如有臨床公認推薦的采樣要求，應(yīng)遵循，并引用相應(yīng)的技術(shù)規(guī)范或指南。描述樣本及核酸提取液的保存穩(wěn)定性。

5.【檢驗方法】

明確核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積，陰陽性質(zhì)控品與待測樣本同步進行核酸提取操作。明確各適用機型的反應(yīng)參數(shù)設(shè)置，基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法，以及各檢測靶標(biāo)對應(yīng)的熒光通道。明確內(nèi)標(biāo)、質(zhì)控的檢測結(jié)果Ct值范圍。

6.【陽性判斷值】

簡述陽性判斷值確定的方法，包括研究人群特征、研究樣本量和統(tǒng)計分析方法等。

7.【檢驗結(jié)果的解釋】

通過擴增曲線和Ct值進行結(jié)果陰陽性的判斷，列明結(jié)果陰性、陽性、灰區(qū)、復(fù)測、無效等所有情形。

8.【檢驗方法局限性】

8.1本試劑檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者臨床癥狀及其他相關(guān)醫(yī)學(xué)檢查結(jié)果進行綜合分析，不得單獨作為患者管理的依據(jù)。

8.2 本產(chǎn)品僅檢測靶標(biāo)區(qū)域內(nèi)突變引起的耐藥。由其他基因或基因區(qū)域的突變、以及其他耐藥機制引起的耐藥本產(chǎn)品不能檢出。

8.3導(dǎo)致假陰性/假陽性結(jié)果的可能性分析：

8.3.1不合理的樣本采集、處理、運輸及保存條件，樣本中目標(biāo)物濃度過低。

8.3.2 待測目標(biāo)基因序列的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖儭?/span>

8.3.3耐藥基因型與表型存在一定的不一致性。

8.3.4未經(jīng)驗證的其他干擾，如內(nèi)源性或外源引入樣本的物質(zhì)。

8.3.5是否受用藥影響，明確與根除治療或其他經(jīng)驗用藥的時間間隔。

9.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】詳述以下性能指標(biāo)：

簡述試劑性能指標(biāo)和研究情況，建議包含：參考品的符合性、準(zhǔn)確性、檢出限、包容性、精密度、分析特異性、臨床試驗等。

10.【注意事項】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

10.1試劑保存運輸及使用過程中多種因素可能導(dǎo)致性能變化，如保存運輸不當(dāng)、樣本采集、樣本處理及檢測過程操作不規(guī)范等，請嚴格按照說明書操作。

10.2生物安全防護相關(guān)內(nèi)容

10.3避免實驗室污染的措施

    三、參考文獻

[1] 國家藥品監(jiān)督管理局. 關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告: 國家藥品監(jiān)督管理局公告2021年第122號[Z].

[2] 國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心.體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則（2023年修訂版）: 國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心公告2024年第1號[Z].

[3] 國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心.定性檢測試劑分析性能評估注冊審查指導(dǎo)原則: 國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心公告2022年第36號[Z].

[4]中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會幽門螺桿菌學(xué)組. 2022中國幽門螺桿菌感染治療指南[J].中華消化雜志,2022,42(11):745-756. 

[5] Malfertheiner P, Megraud F, Rokkas T, et al. Management of Helicobacter pylori infection: the Maastricht VI/Florence consensus report. Gut 2022; 71:1724–1762.

[6] 中華醫(yī)學(xué)會腫瘤學(xué)分會早診早治學(xué)組. 胃癌早診早治中國專家共識（2023版)[J]. 中華消化外科雜志, 2024, 23(1): 23-36.

來源：CMDE

原文下載：幽門螺桿菌耐藥基因突變檢測試劑注冊審查指導(dǎo)原則（征求意見稿) .docx